Molekuliniai aptikimo metodai gali pagaminti didelį nukleorūgščių kiekį amplifikuodami mėginiuose randamus pėdsakus. Nors tai naudinga siekiant užtikrinti jautrų aptikimą, taip pat kyla užteršimo galimybė dėl amplifikacijos aerozolių plitimo laboratorijos aplinkoje. Atliekant eksperimentus, galima imtis priemonių, kad būtų išvengta reagentų, laboratorinės įrangos ir darbo vietos užteršimo, nes toks užteršimas gali lemti klaidingai teigiamus (arba klaidingai neigiamus) rezultatus.
Siekiant sumažinti užteršimo tikimybę, visada reikia laikytis geros laboratorinės praktikos. Visų pirma, reikia imtis atsargumo priemonių dėl šių punktų:
1. Reagentų tvarkymas
2. Darbo vietos ir įrangos organizavimas
3. Paskirtos molekulinės erdvės naudojimo ir valymo patarimai
4. Bendrieji molekulinės biologijos patarimai
5. Vidaus kontrolė
6. Bibliografija
1. Reagentų tvarkymas
Prieš atidarant reagentų mėgintuvėlius trumpai centrifuguokite, kad nesusidarytų aerozolių. Padalinkite reagentus į alikvotines dalis, kad išvengtumėte daugkartinio užšaldymo ir atšildymo bei pagrindinių atsargų užteršimo. Aiškiai paženklinkite ir datuokite visus reagentų ir reakcijos mėgintuvėlius bei saugokite visuose eksperimentuose naudotų reagentų partijų ir serijų numerių žurnalus. Visus reagentus ir mėginius pipete įlašinkite naudodami filtro antgalius. Prieš perkant patartina pasiteirauti gamintojo, ar filtro antgaliai tinka naudojamos pipetės prekės ženklui.
2. Darbo vietos ir įrangos organizavimas
Darbo vieta turėtų būti organizuota taip, kad darbas vyktų viena kryptimi – nuo švarių zonų (prieš PGR) iki nešvarių zonų (po PGR). Šios bendrosios atsargumo priemonės padės sumažinti užteršimo tikimybę. Turėkite atskiras tam skirtas patalpas arba bent jau fiziškai atskiras zonas: pagrindinio mišinio ruošimui, nukleorūgščių ekstrakcijai ir DNR šablono pridėjimui, amplifikacijai ir amplifikuoto produkto tvarkymui bei produkto analizei, pvz., gelio elektroforezei.
Kai kuriais atvejais sunku turėti 4 atskiras patalpas. Galimas, bet mažiau pageidautinas variantas – pagrindinio mišinio ruošimą atlikti izoliacinėje patalpoje, pvz., laminarinio srauto spintoje. Lizdinės PGR amplifikacijos atveju, pagrindinio mišinio ruošimas antrojo etapo reakcijai turėtų būti atliekamas „švarioje“ pagrindinio mišinio ruošimo zonoje, tačiau inokuliacija pirminiu PGR produktu turėtų būti atliekama amplifikacijos patalpoje ir, jei įmanoma, specialioje izoliacinėje patalpoje (pvz., laminarinio srauto spintoje).
Kiekvienam kambariui / zonai reikalingas atskiras aiškiai paženklintų pipečių, filtrų antgalių, mėgintuvėlių laikiklių, sūkurinių maišytuvų, centrifugų (jei taikoma), rašiklių, bendrųjų laboratorinių reagentų, laboratorinių chalatų ir pirštinių dėžių rinkinys, kuris liktų atitinkamose darbo vietose. Judant tarp nurodytų zonų, rankas reikia nusiplauti, o pirštines ir laboratorinius chalatus pasikeisti. Reagentų ir įrangos negalima perkelti iš nešvarios zonos į švarią. Kraštutiniu atveju, kai reagentą ar įrangą reikia perkelti atgal, pirmiausia juos reikia dezinfekuoti 10 % natrio hipochloritu, o po to nuvalyti steriliu vandeniu.
Pastaba
10 % natrio hipochlorito tirpalas turi būti ruošiamas kasdien. Naudojant dezaktyvavimui, sąlyčio laikas turi būti ne trumpesnis kaip 10 minučių.
Jei vietinės saugos rekomendacijos neleidžia naudoti natrio hipochlorito arba jei natrio hipochloritas netinka metalinėms įrangos dalims dezinfekuoti, galima naudoti komerciškai prieinamus produktus, kurie yra patvirtinti kaip DNR ardantys paviršių dezaktyvatoriai.
Idealiu atveju darbuotojai turėtų laikytis vienpusio darbo eigos principo ir tą pačią dieną negrįžti iš nešvarių zonų (po PGR) į švarias zonas (prieš PGR). Tačiau gali būti atvejų, kai to išvengti neįmanoma. Tokiais atvejais personalas privalo kruopščiai nusiplauti rankas, pasikeisti pirštines, dėvėti tam skirtą laboratorinį chalatą ir neįnešti jokios įrangos, kurią norės vėl išsinešti iš kambario, pavyzdžiui, laboratorinių knygų. Tokios kontrolės priemonės turėtų būti pabrėžiamos darbuotojų mokymuose apie molekulinius metodus.
Po naudojimo darbo vietas reikia valyti 10 % natrio hipochloritu (po to steriliu vandeniu, kad būtų pašalinti likę balikliai), 70 % etanoliu arba patvirtintu komerciškai prieinamu DNR ardančiu dezaktyvatoriumi. Idealiu atveju reikėtų įrengti ultravioletines (UV) lempas, kad būtų galima dezinfekuoti švitinant. Tačiau UV lempas reikėtų naudoti tik uždarose darbo vietose, pvz., saugos spintose, siekiant apriboti laboratorijos darbuotojų UV spindulių poveikį. Kad lempos išliktų veiksmingos, laikykitės gamintojo instrukcijų dėl UV lempų priežiūros, vėdinimo ir valymo.
Jei vietoj natrio hipochlorito naudojamas 70 % etanolis, dekontaminacijai užbaigti reikės apšvitinti UV spinduliais.
Nevalykite sūkurinio maišytuvo ir centrifugos natrio hipochloritu; vietoj to nuvalykite 70 % etanoliu ir palaikykite UV spinduliuose arba naudokite komercinę DNR ardančią dekontaminavimo priemonę. Išsipylus, kreipkitės į gamintoją dėl tolesnių valymo patarimų. Jei gamintojo instrukcijos leidžia, pipetes reikia reguliariai sterilizuoti autoklave. Jei pipečių negalima autoklavuoti, turėtų pakakti jas išvalyti 10 % natrio hipochloritu (po to kruopščiai nuvalyti steriliu vandeniu) arba komercine DNR ardančia dekontaminavimo priemone ir paveikinti UV spinduliuose.
Reguliariai valant didelės koncentracijos natrio hipochloritu, pipečių plastikas ir metalai gali būti pažeisti; pirmiausia patikrinkite gamintojo rekomendacijas. Visa įranga turi būti reguliariai kalibruojama pagal gamintojo rekomenduojamą grafiką. Paskirtas asmuo turėtų būti atsakingas už tai, kad būtų laikomasi kalibravimo grafiko, būtų vedami išsamūs žurnalai ir ant įrangos būtų aiškiai matomos techninės priežiūros etiketės.
3. Paskirtos molekulinės erdvės naudojimo ir valymo patarimai
Prieš PGR: Reagentų alikvotinė / pagrindinio mišinio paruošimas: Tai turėtų būti švariausia iš visų erdvių, naudojamų molekuliniams eksperimentams ruošti, ir idealiu atveju tai turėtų būti speciali laminarinio srauto spinta su UV lempa. Šioje zonoje negalima tvarkyti mėginių, išskirtų nukleorūgšties ir amplifikuotų PGR produktų. Amplifikacijos reagentai turėtų būti laikomi šaldiklyje (arba šaldytuve, kaip nurodyta gamintojo rekomendacijose) toje pačioje specialioje erdvėje, geriausia šalia laminarinio srauto spintelės arba prieš PGR atliekamos zonos. Pirštines reikia keisti kiekvieną kartą įeinant į prieš PGR atliekamą zoną arba laminarinio srauto spintelę.
Prieš PGR atliekamą zoną arba laminarinio srauto spintą prieš naudojimą ir po jo reikia valyti taip: visus spintelėje esančius daiktus, pvz., pipetes, antgalių dėžutes, sūkurinį maišytuvą, centrifugą, mėgintuvėlių laikiklius, rašiklius ir kt., nuvalykite 70 % etanoliu arba komerciniu DNR ardančiu dezaktyvatoriumi ir leiskite išdžiūti. Uždaros darbo zonos, pvz., laminarinio srauto spintos, atveju gaubtą 30 minučių palaikykite UV spinduliuose.
Pastaba
Nelaikykite reagentų UV spinduliuose; į spintelę dėkite juos tik tada, kai ji bus švari. Jei atliekama atvirkštinės transkripcijos PGR, taip pat gali būti naudinga paviršius ir įrangą nuvalyti tirpalu, kuris sąlyčio metu skaido RNR. Tai gali padėti išvengti klaidingai neigiamų rezultatų dėl RNR fermentų degradacijos. Po dezaktyvavimo ir prieš ruošiant pagrindinį mišinį, pirštines reikia dar kartą pasikeisti, o tada spintelė yra paruošta naudoti.
Prieš PGR: nukleorūgščių išskyrimas / šablono pridėjimas:
Nukleino rūgštis turi būti išskiriama ir tvarkoma antroje tam skirtoje vietoje, naudojant atskirą pipečių, filtrų antgalių, mėgintuvėlių laikiklių, švarių pirštinių, laboratorinių chalatų ir kitos įrangos rinkinį. Ši vieta taip pat skirta šablonui, kontrolinėms medžiagoms ir tendencijų linijoms į pagrindinio mišinio mėgintuvėlius ar plokšteles įdėti. Siekiant išvengti analizuojamų išskirtų nukleino rūgščių mėginių užteršimo, rekomenduojama prieš tvarkant teigiamas kontrolines medžiagas ar standartus pasikeisti pirštines ir naudoti atskirą pipečių rinkinį. PGR reagentų ir amplifikuotų produktų negalima lašinti pipete šioje vietoje. Mėginiai turėtų būti laikomi tam skirtuose šaldytuvuose arba šaldikliuose toje pačioje vietoje. Mėginių darbo vieta turėtų būti valoma taip pat, kaip ir pagrindinio mišinio erdvė.
Po PGR: amplifikacija ir amplifikuoto produkto tvarkymas
Ši paskirta erdvė skirta procesams po amplifikacijos ir turėtų būti fiziškai atskirta nuo sričių, skirtų procesams prieš PGR. Paprastai joje yra termocikleriai ir realaus laiko platformos, o idealiu atveju joje turėtų būti laminarinio srauto spinta, skirta 1-ojo PGR etapo produktui įdėti į 2-ojo etapo reakciją, jei atliekama įterptinė PGR. Šioje zonoje negalima tvarkyti PGR reagentų ir išskirtos nukleorūgšties, nes yra didelė užteršimo rizika. Šioje zonoje turėtų būti atskiras pirštinių, laboratorinių chalatų, plokštelių ir mėgintuvėlių laikiklių, pipečių, filtrų antgalių, dėžių ir kitos įrangos rinkinys. Prieš atidarant mėgintuvėlius reikia centrifuguoti. Mėginių laikymo vieta turėtų būti valoma taip pat, kaip ir pagrindinio mišinio erdvė.
Po PGR: produkto analizė
Ši patalpa skirta produktų aptikimo įrangai, pvz., gelio elektroforezės talpykloms, maitinimo blokams, UV transiliuminatoriui ir gelio dokumentavimo sistemai. Šioje zonoje turėtų būti atskiri pirštinių rinkiniai, laboratoriniai chalatai, plokštelių ir mėgintuvėlių stovai, pipetės, filtrų antgaliai, šiukšliadėžės ir kita įranga. Į šią zoną negalima įsinešti jokių kitų reagentų, išskyrus įkėlimo dažus, molekulinį žymeklį ir agarozės gelį bei buferio komponentus. Mėginių darbo vieta turi būti valoma taip pat, kaip ir pagrindinio mišinio erdvė.
Svarbi pastaba
Idealiu atveju į PGR tyrimo patalpas nereikėtų eiti tą pačią dieną, jei darbas jau atliktas PGR tyrimo patalpose. Jei tai visiškai neišvengiama, pirmiausia kruopščiai nusiplaukite rankas ir dėvite specialius laboratorinius chalatus. Laboratorinių knygų ir dokumentų negalima įsinešti į PGR tyrimo patalpas, jei jie buvo naudojami PGR tyrimo patalpose; prireikus padarykite protokolų / mėginių ID ir kt. spausdintų kopijų kopijas.
4. Bendrieji molekulinės biologijos patarimai
Kad išvengtumėte tyrimo slopinimo, naudokite pirštines be pudros. Teisinga pipetės technika yra labai svarbi siekiant sumažinti užterštumą. Neteisingas pipetės naudojimas gali sukelti taškymąsi pilant skysčius ir aerozolių susidarymą. Gerą teisingo pipetės naudojimo praktiką galite rasti šiose nuorodose: Gilsono pipetės naudojimo vadovas, „Anachem“ pipetės technikos vaizdo įrašai, centrifugos mėgintuvėliai prieš atidarydami ir atsargiai juos atidarykite, kad išvengtumėte taškymosi. Mėgintuvėlius uždarykite iš karto po naudojimo, kad išvengtumėte teršalų patekimo.
Atliekant kelias reakcijas, paruoškite vieną pagrindinį mišinį, kuriame būtų įprastų reagentų (pvz., vandens, dNTP, buferio, pradmenų ir fermento), kad sumažintumėte reagentų perkėlimų skaičių ir sumažintumėte užteršimo riziką. Rekomenduojama pagrindinį mišinį paruošti ant ledo arba šaltojo bloko. Karšto paleidimo fermento naudojimas gali padėti sumažinti nespecifinių produktų gamybą. Saugokite reagentus, kuriuose yra fluorescencinių zondų, nuo šviesos, kad išvengtumėte jų skaidymosi.
5. Vidaus kontrolė
Visose reakcijose įtraukite gerai apibūdintas, patvirtintas teigiamas ir neigiamas kontrolines medžiagas, taip pat kontrolę be šablono, o kiekybinėms reakcijoms – daugiataškę titruotą tendencijos liniją. Teigiama kontrolė neturėtų būti tokia stipri, kad keltų užteršimo riziką. Atliekant nukleorūgščių ekstrakciją, įtraukite teigiamas ir neigiamas ekstrakcijos kontrolines medžiagas.
Rekomenduojama kiekvienoje zonoje pakabinti aiškias instrukcijas, kad naudotojai žinotų elgesio taisykles. Diagnostinės laboratorijos, klinikiniuose mėginiuose aptinkančios labai mažą DNR arba RNR kiekį, gali norėti imtis papildomų saugumo priemonių – įrengti atskiras oro tvarkymo sistemas su šiek tiek teigiamu oro slėgiu patalpose prieš PGR ir šiek tiek neigiamu oro slėgiu patalpose po PGR.
Galiausiai, naudinga parengti kokybės užtikrinimo (QA) planą. Tokiame plane turėtų būti numatyti pagrindinių ir darbinių reagentų atsargų sąrašai, rinkinių ir reagentų laikymo taisyklės, kontrolės rezultatų ataskaitos, darbuotojų mokymo programos, trikčių šalinimo algoritmai ir prireikus taisomieji veiksmai.
6. Bibliografija
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3 skyrius: KPGR laboratorijos įrengimas. Rekreacinių vandenų tyrimo naudojant USEPA KPGR metodą 1611 gairės. Lansingo-Mičigano valstijos universitetas.
Anglijos visuomenės sveikatos tarnyba, NHS. JK mikrobiologinių tyrimų standartai: gera laboratorinė praktika atliekant molekulinės amplifikacijos tyrimus). Kokybės gairės. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PGR laboratorijos įkūrimas. „Cold Spring Harb Protoc.“ 2007;7.
Schroeder S 2013. Įprasta centrifugų priežiūra: centrifugų, rotorių ir adapterių valymas, priežiūra ir dezinfekavimas (Baltasis dokumentas Nr. 14). Hamburgas: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Gera klinikinė laboratorinė praktika (GCLP), taikoma molekuliniais tyrimais pagrįstiems tyrimams, naudojamiems diagnostikos laboratorijose. In: Akyar I, red. Platus kokybės kontrolės spektras. Rijeka, Kroatija: Intech; 2011: 29–52.
Įrašo laikas: 2020 m. liepos 16 d.
