Molekular Detektiounsmethoden hunn d'Fäegkeet, e grousst Volumen un Nukleinsäure ze produzéieren duerch d'Amplifikatioun vu Spuermengen, déi a Proben fonnt ginn. Dëst ass zwar virdeelhaft fir eng sensibel Detektioun z'erméiglechen, awer et bréngt och d'Méiglechkeet vu Kontaminatioun duerch d'Verbreedung vun Amplifikatiounsaerosolen an der Laborëmfeld mat sech. Bei der Duerchféierung vun Experimenter kënne Moossname getraff ginn, fir d'Kontaminatioun vu Reagenzien, Laborausrüstung a Laborplazen ze vermeiden, well sou eng Kontaminatioun falsch-positiv (oder falsch-negativ) Resultater generéiere kann.
Fir d'Wahrscheinlechkeet vun enger Kontaminatioun ze reduzéieren, solle gutt Laborpraktiken ëmmer agehale ginn. Besonnesch solle Virsiichtsmoossname betreffend déi folgend Punkte getraff ginn:
1. Ëmgang mat Reagenzien
2. Organisatioun vum Aarbechtsberäich an der Ausrüstung
3. Benotzungs- a Botzberodung fir de designéierte molekulare Raum
4. Allgemeng Berodung fir Molekularbiologie
5. Intern Kontrollen
6. Bibliographie
1. Ëmgang mat Reagenzien
Zentrifugéiert d'Reagenzréier kuerz virum Opmaache fir d'Bildung vun Aerosolen ze vermeiden. Dividéiert d'Reagenzien a verschidde Portiounen, fir multiple Afréieren an Optauen an d'Kontaminatioun vun de Master-Stocks ze vermeiden. Beschrëft an datéiert all Reagenz- a Reaktiounsréier kloer a féiert e Protokoll vun de Reagenzlot- an Chargennummeren, déi an allen Experimenter benotzt goufen. Pipetteiert all Reagenzien a Proben mat Filterspëtzen. Virum Kaf ass et ubruecht, mam Hiersteller ze bestätegen, datt d'Filtersspëtzen zur Mark vun der Pipett passen, déi benotzt soll ginn.
2. Organisatioun vum Aarbechtsberäich an der Ausrüstung
Den Aarbechtsberäich soll sou organiséiert sinn, datt den Aarbechtsoflaf an eng Richtung stattfënnt, vu propperen Beräicher (virun der PCR) bis zu dreckege Beräicher (no der PCR). Déi folgend allgemeng Virsiichtsmoossname hëllefen, d'Chance op Kontaminatioun ze reduzéieren. Sidd virgesinn fir separat designéiert Raim oder op d'mannst kierperlech getrennt Beräicher fir: Mastermixvirbereedung, Nukleinsäureextraktioun an DNA-Schablounenzousetzung, Amplifikatioun an Ëmgang mat amplifizéiertem Produkt, a Produktanalyse, z.B. Gelelektrophorese.
A verschiddene Situatiounen ass et schwéier, 4 separat Raim ze hunn. Eng méiglech, awer manner wënschenswäert Optioun ass, d'Virbereedung vum Mastermix an engem Ofspärungsberäich ze maachen, z.B. an engem Laminar-Flow-Schrank. Am Fall vun enger verschachtelter PCR-Amplifikatioun soll d'Virbereedung vum Mastermix fir déi zweet Reaktiounsronn am 'propperen' Beräich fir d'Virbereedung vum Mastermix virbereet ginn, awer d'Inokulatioun mam primäre PCR-Produkt soll am Amplifikatiounsraum gemaach ginn, a wa méiglech an engem speziellen Ofspärungsberäich (z.B. an engem Laminar-Flow-Schrank).
All Raum/Beräich brauch e separaten Set vu kloer markéierten Pipetten, Filterspëtzen, Réierregaler, Vortexen, Zentrifugen (wann zoutreffend), Stëfter, generesche Laborreagenzien, Labormäntel a Këschte mat Handschuesch, déi op de jeeweilegen Aarbechtsstatiounen bleiwen. Hänn musse gewäsch ginn an Handschuesch a Labormäntel musse gewiesselt ginn, wann een tëscht den designéierte Beräicher wiesselt. Reagenzien an Ausrüstung däerfen net vun engem dreckegen Deel an e propperen Deel geréckelt ginn. Am Fall vun engem extremen Fall, wou e Reagens oder en Ausrüstungsstéck no hannen muss geréckelt ginn, muss et als éischt mat 10% Natriumhypochlorit dekontaminéiert ginn, an duerno mat sterilem Waasser ofgewëscht ginn.
Notiz
Déi 10% Natriumhypochlorit-Léisung muss all Dag frësch preparéiert ginn. Wann se fir Dekontaminatioun benotzt gëtt, soll eng Mindestkontaktzäit vun 10 Minutten agehale ginn.
Alternativ kënnen kommerziell verfügbar Produkter, déi als DNA-zerstéierend Uewerflächendekontaminatiounsmëttel validéiert sinn, benotzt ginn, wa lokal Sécherheetsempfehlungen d'Benotzung vu Natriumhypochlorit net erlaben oder wa Natriumhypochlorit net fir d'Dekontaminatioun vun de metalleschen Deeler vun Ausrüstung gëeegent ass.
Am Idealfall soll d'Mataarbechter sech un den unidirektionalen Aarbechtsprozess halen an net nach um selwechten Dag vun dreckege Beräicher (no der PCR) zréck an propper Beräicher (virun der PCR) goen. Et kann awer Fäll ginn, wou dat onvermeidbar ass. Wann esou e Fall optrëtt, muss d'Mataarbechter oppassen, d'Hänn grëndlech ze wäschen, d'Handschuesch ze wiesselen, de designéierte Labormantel ze droen an keng Ausrüstung matzehuelen, déi se aus dem Raum mathuele wëllen, wéi zum Beispill Laborbicher. Dës Kontrollmoossname sollten an der Ausbildung vum Personal iwwer molekular Methoden ervirgehuewe ginn.
Nom Gebrauch solle Plazen op der Aarbechtsbank mat 10% Natriumhypochlorit (gefollegt vu sterilem Waasser fir Reschtbleichmëttel ze entfernen), 70% Ethanol oder engem validéierten, kommerziell verfügbaren DNA-zerstéierenden Dekontaminatiounsmëttel gebotzt ginn. Am Idealfall solle Ultraviolettlampen (UV-Lampen) installéiert ginn, fir d'Dekontaminatioun duerch Bestrahlung z'erméiglechen. D'Benotzung vun UV-Lampen soll awer op zouen Aarbechtsberäicher limitéiert sinn, z.B. Sécherheetsschränke, fir d'UV-Bestrahlung vum Laborpersonal ze limitéieren. Halt Iech w.e.g. un d'Instruktioune vum Hiersteller fir d'Pfleeg, d'Belëftung an d'Botzen vun der UV-Lampe, fir sécherzestellen, datt d'Lampen effektiv bleiwen.
Wann 70% Ethanol amplaz vun Natriumhypochlorit benotzt gëtt, ass Bestrahlung mat UV-Liicht néideg fir d'Dekontaminatioun ofzeschléissen.
Botzt de Vortex an d'Zentrifugatioun net mat Natriumhypochlorit; wëscht amplaz mat 70% Ethanol of a setzt se UV-Liicht aus, oder benotzt en kommerziellen DNA-zerstéierenden Dekontaminant. Am Fall vu Verschëtter, kontaktéiert den Hiersteller fir weider Botzberodung. Wann d'Instruktioune vum Hiersteller et erlaben, solle Pipetten routineméisseg autoklavéiert ginn. Wann Pipetten net autoklavéiert kënne ginn, sollt et duergoen, se mat 10% Natriumhypochlorit (gefollegt vun engem grëndleche Wëschen mat sterilem Waasser) oder mat engem kommerziellen DNA-zerstéierenden Dekontaminant an duerno UV-Beliichtung ze botzen.
Botzen mat Natriumhypochlorit mat héijem Prozentsaz kann eventuell Pipettplastik a Metaller beschiedegen, wann et reegelméisseg gemaach gëtt; kontrolléiert als éischt d'Empfehlungen vum Hiersteller. All Ausrüstung muss reegelméisseg no dem vum Hiersteller recommandéierte Plang kalibréiert ginn. Eng designéiert Persoun soll dofir verantwortlech sinn, datt de Kalibratiounsplang agehale gëtt, detailléiert Protokoller gefouert ginn an d'Serviceetiketten kloer um Ausrüstung ugewise sinn.
3. Benotzungs- a Botzberodung fir de designéierte molekulare Raum
Pre-PCR: Reagensalikvotéierung / Mastermixvirbereedung: Dëst sollt de propperste vun all de Raim sinn, déi fir d'Virbereedung vu molekulare Experimenter benotzt ginn, an am Idealfall e speziellen Laminar-Flow-Schrank mat engem UV-Luucht sinn. Proben, extrahéiert Nukleinsäure an amplifizéiert PCR-Produkter däerfen net an dësem Beräich behandelt ginn. Amplifikatiounsreagenzien sollten an engem Gefrierschrank (oder am Frigo, no den Empfehlungen vum Hiersteller) am selwechte designéierte Raum gelagert ginn, am Idealfall nieft dem Laminar-Flow-Schrank oder dem Pre-PCR-Beräich. D'Handschuesch sollten all Kéier beim Antrëtt an de Pre-PCR-Beräich oder dem Laminar-Flow-Schrank gewiesselt ginn.
De Pre-PCR-Beräich oder de Laminar-Flow-Schrank soll virun an nom Gebrauch wéi follegt gebotzt ginn: All Saachen am Schrank, z.B. Pipetten, Spëtzekëschten, Vortex, Zentrifuge, Réierregaler, Stifter, etc., ginn mat 70% Ethanol oder engem kommerziellen DNA-zerstéierende Dekontaminant ofgewëscht a loossen dréchnen. Am Fall vun engem zouenen Aarbechtsberäich, z.B. engem Laminar-Flow-Schrank, d'Dispose 30 Minutte laang UV-Liicht aussetzen.
Notiz
Setzt d'Reagenzien net UV-Liicht aus; bréngt se eréischt an de Schaf, wann en propper ass. Wann Dir eng Reverse-Transkriptiouns-PCR duerchféiert, kann et och hëllefräich sinn, Uewerflächen an Ausrüstung mat enger Léisung ofzewëschen, déi RNasen bei Kontakt ofbaut. Dëst kann hëllefen, falsch-negativ Resultater duerch Enzymofbau vun der RNA ze vermeiden. No der Dekontaminatioun a virun der Virbereedung vum Mastermix sollten d'Handschuesch nach eng Kéier gewiesselt ginn, an dann ass de Schaf prett fir ze benotzen.
Pre-PCR: Nukleinsäureextraktioun/Schablounenzousetzung:
Nukleinsäure muss an engem zweete designéierte Beräich extrahéiert a behandelt ginn, mat engem separaten Set Pipetten, Filterspëtzen, Réierregaler, frësche Handschuesch, Labormäntel an aner Ausrüstung. Dëse Beräich ass och fir d'Zousätzlech vun der Schabloun, Kontrollen an Trendlinnen an d'Mastermix-Réier oder -Placken. Fir d'Kontaminatioun vun den extrahéierten Nukleinsäureprouwen, déi analyséiert ginn, ze vermeiden, ass et recommandéiert, d'Handschuesch virum Ëmgang mat positiven Kontrollen oder Standarden ze wiesselen an e separaten Set Pipetten ze benotzen. PCR-Reagenzien an amplifizéiert Produkter däerfen an dësem Beräich net pipetteiert ginn. D'Prouwen sollen an designéierte Frigoen oder Gefrierschränken am selwechte Beräich gelagert ginn. Den Aarbechtsberäich fir d'Prouwen soll op déiselwecht Aart a Weis wéi de Mastermix-Raum gebotzt ginn.
Post-PCR: Amplifikatioun an Ëmgang mam amplifizéierte Produkt
Dëse Raum ass fir Post-Amplifikatiounsprozesser geduecht a soll kierperlech vun de Pre-PCR-Beräicher getrennt sinn. En enthält normalerweis Thermocycleren a Echtzäit-Plattformen, an am Idealfall soll en e Laminar-Flow-Schrank hunn fir d'PCR-Produkt vun der 1. Ronn an d'Reaktioun vun der 2. Ronn bäizefügen, wa geschachtelt PCR duerchgefouert gëtt. PCR-Reagenzien an extrahéiert Nukleinsäure däerfen net an dësem Beräich behandelt ginn, well de Risiko vu Kontaminatioun héich ass. Dëse Beräich soll e separaten Set Handschuesch, Labormäntel, Placken- a Réierregaler, Pipetten, Filterspëtzen, Behälter an aner Ausrüstung hunn. D'Réier mussen virum Opmaache zentrifugéiert ginn. Den Aarbechtsberäich fir d'Prouf soll op déiselwecht Aart a Weis wéi de Mastermix-Raum gebotzt ginn.
Post-PCR: Produktanalyse
Dëse Raum ass fir Produktdetektiounsausrüstung, z.B. Gelelektrophoresebehälter, Stroumversuergungspacks, UV-Transilluminator an de Geldokumentatiounssystem. Dëse Beräich sollt separat Sätz vun Handschuesch, Labormäntel, Placken- a Réierregaler, Pipetten, Filterspëtzen, Behälter an aner Ausrüstung hunn. Keng aner Reagenzien däerfen an dëse Beräich bruecht ginn, ausser Ladefaarfstoff, Molekularmarker an Agarosegel, souwéi Pufferkomponenten. De Proufberäich soll op déiselwecht Aart a Weis wéi de Mastermixraum gebotzt ginn.
Wichteg Notiz
Am Idealfall sollten d'Pre-PCR-Raume net nach um selwechten Dag eragaange ginn, wann an de Post-PCR-Raume schonn Aarbecht geleescht gouf. Wann dëst komplett onvermeidbar ass, gitt sécher datt d'Hänn als éischt grëndlech gewäsch ginn an datt speziell Labormäntel an de Raim gedroe ginn. Laborbicher a Pabeieren däerfen net an d'Pre-PCR-Raume matgeholl ginn, wa se an de Post-PCR-Raume benotzt goufen; wann néideg, maacht Duplikatausdréck vu Protokoller/Prouf-IDen, etc.
4. Allgemeng Berodung fir Molekularbiologie
Benotzt puderfräi Handschuesch fir d'Assayhemmung ze vermeiden. Déi richteg Pipettéierungstechnik ass vun essentiellem Wäert fir d'Kontaminatioun ze reduzéieren. Falsch Pipettéierung kann zu Sprëtzer beim Doséiere vu Flëssegkeeten an zur Bildung vun Aerosolen féieren. Gutt Praktike fir déi richteg Pipettéierung fannt Dir op de folgende Linken: Gilson Guide to Pipetting, Anachem Pipettetechnikvideoen, Zentrifugéierréier virum Opmaache a maacht se virsiichteg op fir Sprëtzer ze vermeiden. Maacht d'Réier direkt nom Gebrauch zou fir d'Aféierung vu Kontaminanten ze vermeiden.
Wann Dir verschidde Reaktiounen duerchféiert, preparéiert een eenzege Mastermix mat gemeinsame Reagenzien (z.B. Waasser, dNTPs, Puffer, Primer an Enzym), fir d'Zuel vun den Reagenztransferten ze minimiséieren an d'Gefor vu Kontaminatioun ze reduzéieren. Et ass recommandéiert, de Mastermix op Äis oder engem kale Block opzestellen. D'Benotzung vun engem Hot Start-Enzym kann hëllefen, d'Produktioun vun net-spezifesche Produkter ze reduzéieren. Schützt Reagenzien, déi fluoreszent Sonden enthalen, virum Liicht, fir Degradatioun ze vermeiden.
5. Intern Kontrollen
Integréiert gutt charakteriséiert, bestätegt positiv an negativ Kontrollen, zesumme mat enger Kontroll ouni Schabloun an alle Reaktiounen, an eng Multipunkt-titréiert Trendlinn fir quantitativ Reaktiounen. Déi positiv Kontroll soll net sou staark sinn, datt se e Kontaminatiounsrisiko duerstellt. Integréiert positiv an negativ Extraktiounskontrollen wann Dir Nukleinsäureextraktioun duerchféiert.
Et ass recommandéiert, datt kloer Instruktiounen an all Beräich opgehaangen ginn, fir datt d'Benotzer iwwer d'Verhalensregelen informéiert sinn. Diagnostiklaboratoiren, déi ganz niddreg DNA- oder RNA-Niveauen a klinesche Prouwe feststellen, kënnen déi zousätzlech Sécherheetsmoossnam adoptéieren, andeems se separat Loftbehandlungssystemer mat liicht positivem Loftdrock an de Raim virun der PCR an liicht negativem Loftdrock an de Raim no der PCR hunn.
Schlussendlech ass d'Entwécklung vun engem Qualitéitssécherungsplang (QA) hëllefräich. Sou e Plang sollt Lëschte vu Reagenzstam- a Schaffbestänn, Reegele fir d'Lagerung vu Kits a Reagenzien, d'Berichterstattung vu Kontrollresultater, Ausbildungsprogrammer fir de Personal, Algorithmen fir d'Feelerbehebung a Korrekturmoossnamen enthalen, wann néideg.
6. Bibliographie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Opbau vun engem qPCR-Laboratoire. E Richtlinndokument fir d'Testung vu Fräizäitgewässer mat der USEPA qPCR Method 1611. Lansing- Michigan State University.
Public Health England, NHS. UK Standarden fir mikrobiologisch Ënnersichungen: Gutt Laboratoirepraktiken bei der Duerchféierung vu molekulare Amplifikatiounstester). Qualitéitsrichtlinnen. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Opbau vun engem PCR-Laboratoire. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Reegelméisseg Ënnerhalt vun Zentrifugen: Botzen, Ënnerhalt an Desinfektioun vun Zentrifugen, Rotoren an Adapteren (Wäisst Pabeier Nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Gudde klineschen Laboratoirepraktiken (GCLP) fir molekularbaséiert Tester, déi an Diagnoselaboratoiren agesat ginn, In: Akyar I, Editeur. Breet Spektrum vun der Qualitéitskontroll. Rijeka, Kroatien: Intech; 2011: 29–52.
Zäitpunkt vun der Verëffentlechung: 16. Juli 2020
