Methodi detectionis molecularis facultatem habent magnum volumen acidi nucleici producendi per amplificationem quantitatum vestigialium in exemplaribus inventarum. Dum hoc utile est ad detectionem sensibilem efficiendam, etiam possibilitatem contaminationis per diffusionem aerosolorum amplificationis in ambitu laboratorium inducit. Dum experimenta peraguntur, mensurae suscipi possunt ad contaminationem reagentium, instrumentorum laboratorium et spatii scamni vitandam, cum talis contaminatio eventus falsos positivos (vel falsos negativos) generare possit.
Ad probabilitatem contaminationis minuendam, Bona Praxis Laboratoria semper adhibenda est. Praesertim, cautiones de his rebus adhibendae sunt:
1. Tractatio reagentium
2. Ordinatio spatii laboris et instrumentorum
3. Consilia usus et purgationis pro spatio moleculari designato
4. Consilia generalia de biologia moleculari
5. Moderationes internae
6. Bibliographia
1. Tractatio reagentium
Tubos reagentium breviter centrifuga antequam aperiantur ne aerosola generentur. Reagentia aliquotatim divide ne congelatio et liquefactio multiplices et contaminatio copiarum magistralium fiant. Omnes tubos reagentium et reactionis clare nota et data, et acta numerorum partium et partium reagentium in omnibus experimentis adhibitorum conserva. Omnia reagentia et exempla apicibus filtrantibus pipettare. Ante emptionem, expedit cum fabricante confirmare apices filtrantes marcae pipettae adhibendae congruere.
2. Ordinatio spatii laboris et instrumentorum
Spatium laboris ita ordinandum est ut fluxus operis uno modo fiat, ab areis mundis (ante-PCR) ad areas sordidas (post-PCR). Hae cautiones generales periculum contaminationis minuere adiuvabunt. Cubicula separata et designata, vel saltem areas physice separatas, habe ad: praeparationem mixturae principalis, extractionem acidi nucleici et additionem exemplaris ADN, amplificationem et tractationem producti amplificati, et analysin producti, e.g. electrophoresis in gel.
In quibusdam condicionibus, quattuor conclavia separata habere difficile est. Optio possibilis sed minus optanda est praeparationem mixturae principalis in area continentiae, exempli gratia armario fluxus laminaris, perficere. In casu amplificationis PCR inclusae, praeparatio mixturae principalis pro reactione secunda in area "pura" ad praeparationem mixturae principalis praeparari debet, sed inoculatio cum producto PCR primario in conclavi amplificationis fieri debet, et si fieri potest in area continentiae dedicata (exempli gratia armario fluxus laminaris).
Cubiculum/area singulae stationes separatas pipettarum, apicibus filtratoriis, cratibus tuborum, vorticibus, centrifugis (si opus est), calamis, reagentibus genericis, tunicis et capsis chirothecarum, clare inscriptas, requirunt, quae in suis stationibus laboris manebunt. Manus lavandae sunt et chirothecae ac tunicae mutandae cum inter areas designatas movetur. Reagentia et apparatus non ex area sordida in aream mundam movendi sunt. Si casus extremus oriatur ubi reagens vel pars apparatus retrorsum movenda sit, primum cum hypochlorito natrii 10% decontaminanda est, deinde aqua sterili detergenda.
Nota
Solutio hypochloriti natrii decem centesimarum quotidie recens praeparanda est. Cum ad decontaminationem adhibeatur, minimum tempus contactus decem minutorum observandum est.
Alternatim, producta in commercio praesto quae ut decontaminantia superficierum DNA destruentia probata sunt, adhiberi possunt si commendationes locales salutis usum hypochloriti natrii non permittunt vel si hypochloritum natrii non aptum est ad partes metallicas instrumentorum decontaminandas.
Optime, ut operarii ethos unidirectionalem operis sequantur neque eodem die a locis sordidis (post-PCR) ad loca munda (ante-PCR) revertantur. Tamen, interdum hoc inevitabile est. Cum talis occasio oritur, operarii diligenter manus lavent, chirothecas mutent, togam laboratorium designatam utantur, neque ullum instrumentum quod iterum ex cubiculo proferre velint, ut libros laboratorium, introducant. Tales mensurae moderationis in institutione operariorum de methodis molecularibus urgendae sunt.
Post usum, spatia in scamnis purganda sunt cum hypochlorito natrii 10% (deinde aqua sterili ad residua lixivia removenda), aethanolo 70%, vel decontaminante DNA destruente in commercio probato. Optime, lampades ultraviolaceae (UV) aptandae sunt ad decontaminationem per irradiationem permittendam. Attamen usus lampadum UV ad areas laboris clausas, e.g. armariis securitatis, restringendus est ut expositionem UV ministrorum laboratorium limitet. Quaeso, instructiones fabricatoris de cura, ventilatione et purgatione lampadum UV sequere ut lampades efficaces maneant.
Si ethanolum 70% loco hypochloriti natrii uteris, irradiatio lumine ultraviolaceo necessaria erit ad decontaminationem perficiendam.
Vorticem et centrifugam ne natrii hypochlorito purges; potius, ethanolo 70% deterge et luci ultraviolacea expone, vel decontaminante commerciali DNA destruente utere. Pro effusionibus, cum fabricante pro ulteriore consilio purgationis consule. Si instructiones fabricatoris permittunt, pipettae regulariter sterilizandae sunt autoclave. Si pipettae non possunt autoclavari, sufficere debet eas natrii hypochlorito 10% purgare (deinde diligenter aqua sterili detergendo) vel decontaminante commerciali DNA destruente deinde expositione UV.
Purgatio cum hypochlorito natrii altae portionis, si regulariter fiat, plastica et metalla pipettarum tandem laedere potest; primum commendationes a fabricante inspice. Omnia instrumenta regulariter secundum ordinem a fabricante commendatum calibranda sunt. Persona designata curam habere debet ut ordo calibrationis observetur, diaria accurata conserventur, et inscriptiones servitii clare in instrumentis ostendantur.
3. Consilia usus et purgationis pro spatio moleculari designato
Prae-PCR: Aliquotatio reagentium / praeparatio mixturae principalis: Hoc spatium omnium ad experimenta molecularia praeparanda mundissimum esse debet et idealiter armarium fluxus laminaris designatum, luce UV instructum, esse debet. Exempla, acidum nucleicum extractum et producta PCR amplificata in hac area non tractanda sunt. Reagentia amplificationis in congelatore (vel armario frigorifico, secundum commendationes fabricatoris) in eodem spatio designato conservanda sunt, idealiter iuxta armarium fluxus laminaris vel aream prae-PCR. Chirothecae quotiescumque aream prae-PCR vel armarium fluxus laminaris ingrediuntur mutandae sunt.
Area prae-PCR vel armarium fluxus laminaris ante et post usum sic purgandum est: Omnia in armario, e.g. pipettas, capsas apicum, vorticem, centrifugam, crates tuborum, calamos, etc., cum ethanolo 70% vel decontaminante commerciali DNA destruente deterge et siccari sine. In casu areae laboris clausae, e.g. armarii fluxus laminaris, cucullum luci UV per 30 minuta expone.
Nota
Reagentia luci ultraviolacea ne exponas; ea in armarium tantum move postquam mundum est. Si PCR transcriptionis reversae peragitur, utile etiam esse potest superficies et apparatum solutione detergere quae RNases contactu dissolvit. Hoc adiuvare potest ne eventus falso negativos ex degradatione enzymatica RNA oriantur. Post decontaminationem et antequam mixtura magistralis praeparatur, chirothecae iterum mutandae sunt, et tum armarium ad usum paratum est.
Prae-PCR: Extractio acidi nucleici/additio exemplaris:
Acidum nucleicum in altera area designata extrahi et tractari debet, utendo separato pari pipettarum, apicibus filtratoriis, cratibus tuborum, chirothecis recentibus, tunicis laboratorium, aliisque instrumentis. Haec area etiam est ad addendum exemplar, moderamina, et lineas inclinationis tuborum vel laminarum mixtionis magistralis. Ne contaminatio exemplorum acidi nucleici extractorum quae analysantur fiat, commendatur ut chirothecas mutentur antequam moderamina positiva vel normas tractentur, et separato pari pipettarum utatur. Reagentia PCR et producta amplificata non debent pipettari in hac area. Exempla in designatis frigidariis vel congelatoribus in eadem area conservanda sunt. Spatium laboris exemplorum eodem modo quo spatium mixtionis magistralis purgandum est.
Post-PCR: Amplificatio et tractatio producti amplificati
Hoc spatium designatum est processibus post-amplificationis et physice separatum esse debet a locis prae-PCR. Solet continere thermocyclos et suggestus temporis realis, et idealiter habere debet armarium fluxus laminaris ad addendum productum PCR primae rondae ad reactionem secundae rondae, si PCR inclusa perficitur. Reagentia PCR et acidum nucleicum extractum non tractanda sunt in hac area quia periculum contaminationis magnum est. Haec area separatum apparatum chirothecarum, tunicarum laboratorium, crates laminarum et tuborum, pipettas, apices filtrorum, cistas et alia instrumenta habere debet. Tubi centrifugandi sunt ante aperitionem. Spatium laboris speciminis eodem modo quo spatium mixtionis principalis purgandum est.
Post-PCR: Analysis producti
Haec camera apparatu detectionis productorum destinatur, exempli gratia cisternis electrophoresis in gel, accumulatoribus potentiae, transilluminatore UV et systemate documentationis gel. Haec area separatas chirothecarum, tunicarum laboratorium, crates laminarum et tuborum, pipettas, apices filtrorum, cistas et alia instrumenta habere debet. Nulla alia reagentia in hanc aream inferri possunt, exceptis tinctura onerandi, indice moleculari et gel agarose, et componentibus tamponis. Spatium laboris speciminis eodem modo quo spatium mixtionis magistralis purgandum est.
Nota magni momenti
Optime, cubicula ante-PCR non eodem die ingredi debent si opus iam in cubiculis post-PCR peractum est. Si hoc omnino inevitabile est, curare ut manus prius diligenter laventur et ut togae laboratorium specificae in cubiculis gerantur. Libri et documenta laboratorium non in cubicula ante-PCR inferenda sunt si in cubiculis post-PCR adhibita sunt; si opus est, exempla impressa protocollorum/identificationum exemplorum, etc., capiantur.
4. Consilia generalia de biologia moleculari
Chirothecas sine pulvere adhibe ne inhibitionem experimenti patiaris. Recta ars pipetandi maximi momenti est ad contaminationem minuendam. Pipetatio incorrecta aspersionem liquidorum et creationem aerosolorum efficere potest. Bona praxis ad rectam pipetationem inveniri potest in his nexibus: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting art videos, Centrifuge tubes before opening, et caute aperi ne aspersa fiant. Claude tubos statim post usum ne contaminantes introducantur.
Cum plures reactiones perficis, unam mixturam magistralem (mastermix) reagentia communia (e.g., aquam, dNTPs, liquorem tamponem, initia et enzymum) continentem para, ut numerus translationum reagentium minuatur et periculum contaminationis reducatur. Commendatur ut mixtura magistralis in glacie vel lapide frigido disponatur. Usus enzymi "Hot Start" (initii calidi) adiuvare potest ad productionem productorum non specificorum minuendam. Reagentia probas fluorescentes continentia a luce protege ne degradetur.
5. Moderationes internae
Includantur moderamina positiva et negativa bene distincta et confirmata, una cum moderamine sine exemplari in omnibus reactionibus, et linea trendi titrata multipuncta pro reactionibus quantitativis. Moderatio positiva non debet esse tam valida ut periculum contaminationis praebeat. Cum extractio acidi nucleici perficitur, moderamina extractionis positiva et negativa includenda sunt.
Suadetur ut instructiones clarae in singulis locis affigantur, ut utentes regulas agendi cognoscant. Laboratoria diagnostica quae parvas quantitates DNA vel RNA in exemplaribus clinicis detegunt, fortasse mensuram securitatis additam adhibere velint, scilicet systemata separata tractationis aeris habenda cum pressione aeris paulo positiva in conclavibus ante-PCR et pressione aeris paulo negativa in conclavibus post-PCR.
Denique, utile est consilium qualitatis curandae (QA) elaborare. Tale consilium indices copiarum principalium reagentium et copiarum operantium, regulas ad apparatus et reagentia conservanda, relationem eventuum inspectionis, programmata institutionis ministrorum, algorithmos difficultatum investigandarum, et actiones remediales, si opus sit, comprehendere debet.
6. Bibliographia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Caput III: Laboratorium qPCR instituendum. Documentum directionis ad aquas recreationales examinandas utens methodo USEPA qPCR 1611. Lansing-Michigan State University.
Salus Publica Angliae, NHS. Normae Britannicae ad investigationes microbiologicas: Bona Praxis Laboratoria in perficiendis probationibus amplificationis molecularis. Consilium Qualitatis. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. *De institutione laboratorium PCR*. *Cold Spring Harb Protoc.* 2007;7.
Schroeder S 2013. *De cura ordinaria centrifugarum: purgatio, cura et disinfectione centrifugarum, rotorum et adaptatorum* (Charta alba No. 14). Hamburgi: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bona Praxis Laboratorii Clinici (GCLP) pro probationibus molecularibus in laboratoriis diagnosticis adhibitis, In: Akyar I, editore. Lata spectra moderationis qualitatis. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Tempus publicationis: XVI Iulii MMXX
