분자 검출법은 시료에서 발견되는 미량의 핵산을 증폭하여 대량의 핵산을 생성할 수 있습니다. 이는 민감한 검출을 가능하게 하는 데 유리하지만, 실험실 환경 내 증폭 에어로졸 확산으로 인한 오염 가능성도 있습니다. 실험 수행 시 시약, 실험실 장비 및 실험대 공간의 오염을 방지하기 위한 조치를 취해야 합니다. 이러한 오염은 위양성(또는 위음성) 결과를 초래할 수 있기 때문입니다.
오염 가능성을 줄이기 위해, 항상 우수실험실관리기준(GLP)을 준수해야 합니다. 특히 다음 사항에 대한 예방 조치를 취해야 합니다.
1. 시약 취급
2. 작업 공간 및 장비 구성
3. 지정된 분자 공간에 대한 사용 및 세척 조언
4. 일반 분자생물학 조언
5. 내부 통제
6. 참고문헌
1. 시약 취급
에어로졸 생성을 방지하기 위해 시약 튜브를 개봉하기 전에 잠시 원심분리하십시오. 여러 번의 동결-해동과 마스터 스톡의 오염을 방지하기 위해 시약을 분주하십시오. 모든 시약 및 반응 튜브에 라벨을 붙이고 날짜를 기입하고 모든 실험에 사용된 시약 로트 및 배치 번호를 기록하십시오. 필터 팁을 사용하여 모든 시약과 샘플을 피펫으로 채취하십시오. 구매 전에 필터 팁이 사용할 피펫 브랜드에 맞는지 제조업체에 확인하는 것이 좋습니다.
2. 작업 공간 및 장비 구성
작업 공간은 깨끗한 공간(PCR 전)에서 더러운 공간(PCR 후)으로 일방향으로 작업이 진행되도록 구성해야 합니다. 다음과 같은 일반적인 예방 조치는 오염 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다. 마스터믹스 제조, 핵산 추출 및 DNA 템플릿 첨가, 증폭 산물의 증폭 및 취급, 그리고 겔 전기영동과 같은 산물 분석을 위해 별도의 지정된 공간 또는 최소한 물리적으로 분리된 공간을 마련하십시오.
어떤 환경에서는 4개의 별도 방을 두는 것이 어려울 수 있습니다. 가능하지만 덜 바람직한 방법은 층류 캐비닛과 같은 격리 구역에서 마스터믹스 제조를 하는 것입니다. 중첩 PCR 증폭의 경우, 2차 반응을 위한 마스터믹스 제조는 마스터믹스 제조를 위한 '청결' 구역에서 해야 하지만, 1차 PCR 산물의 접종은 증폭실에서, 그리고 가능하면 전용 격리 구역(예: 층류 캐비닛)에서 해야 합니다.
각 방/구역에는 명확하게 라벨이 부착된 피펫, 필터 팁, 튜브 랙, 볼텍스, 원심분리기(해당하는 경우), 펜, 일반 실험 시약, 실험복, 그리고 장갑 상자가 각각 하나씩 필요하며, 각 세트는 해당 작업대에 비치되어야 합니다. 지정된 구역 간 이동 시에는 손을 씻고 장갑과 실험복을 갈아입어야 합니다. 시약과 장비는 더러운 구역에서 깨끗한 구역으로 옮겨서는 안 됩니다. 시약이나 장비를 뒤로 옮겨야 하는 극단적인 경우에는 먼저 10% 차아염소산나트륨으로 소독한 후 멸균수로 닦아내야 합니다.
메모
10% 차아염소산나트륨 용액은 매일 새로 만들어야 합니다. 오염 제거에 사용할 경우, 최소 10분 동안 접촉해야 합니다.
또는 현지 안전 권장 사항에 따라 차아염소산나트륨 사용이 허용되지 않거나 차아염소산나트륨이 장비의 금속 부분을 오염 제거하는 데 적합하지 않은 경우, DNA 파괴 표면 오염 제거제로 검증된 시중 제품을 사용할 수 있습니다.
이상적으로는 직원들이 일방적인 업무 흐름 원칙을 준수하고, 같은 날 더러운 구역(PCR 후)에서 깨끗한 구역(PCR 전)으로 돌아가지 않아야 합니다. 하지만 불가피한 경우도 있을 수 있습니다. 이러한 상황이 발생하면 직원들은 손을 깨끗이 씻고, 장갑을 교체하고, 지정된 실험실 가운을 착용하고, 실험실에서 다시 꺼내고 싶은 장비(예: 실험 기록지)는 반입하지 않도록 주의해야 합니다. 분자생물학적 방법론에 대한 직원 교육 시 이러한 관리 조치를 강조해야 합니다.
사용 후, 작업대 공간은 10% 차아염소산나트륨(잔류 표백제를 제거하기 위해 멸균수 사용), 70% 에탄올, 또는 검증된 시판 DNA 파괴 오염제거제로 청소해야 합니다. 이상적으로는 자외선(UV) 램프를 설치하여 방사선 조사에 의한 오염제거가 가능하도록 해야 합니다. 그러나 실험실 직원의 자외선 노출을 최소화하기 위해 UV 램프 사용은 안전 캐비닛과 같은 밀폐된 작업 공간에서만 사용해야 합니다. 램프의 효과를 유지하기 위해 UV 램프 관리, 환기 및 청소에 대한 제조업체의 지침을 준수하십시오.
차아염소산나트륨 대신 70% 에탄올을 사용하는 경우, 오염 제거를 완료하기 위해 자외선 조사가 필요합니다.
와류와 원심분리기를 차아염소산나트륨으로 세척하지 마십시오. 대신 70% 에탄올로 닦아내고 자외선에 노출시키거나 시판 DNA 파괴 오염제거제를 사용하십시오. 유출된 경우, 제조사에 문의하여 세척 방법에 대한 추가 지침을 받으십시오. 제조사의 지침에 따라 가능하다면 피펫은 정기적으로 고압멸균기를 사용하여 살균해야 합니다. 피펫을 고압멸균할 수 없는 경우, 10% 차아염소산나트륨으로 세척한 후 멸균수로 깨끗이 닦거나 시판 DNA 파괴 오염제거제로 세척한 후 자외선에 노출시키면 됩니다.
고농도 차아염소산나트륨으로 정기적으로 세척할 경우 피펫 플라스틱과 금속이 손상될 수 있습니다. 먼저 제조업체의 권장 사항을 확인하십시오. 모든 장비는 제조업체 권장 일정에 따라 정기적으로 교정해야 합니다. 지정된 담당자가 교정 일정을 준수하고, 상세한 기록을 유지하며, 장비에 서비스 라벨을 명확하게 표시해야 합니다.
3. 지정된 분자 공간에 대한 사용 및 세척 조언
PCR 전: 시약 분주/마스터믹스 준비: 분자 실험 준비에 사용되는 모든 공간 중 가장 깨끗해야 하며, 이상적으로는 자외선 조명이 설치된 지정된 층류 캐비닛이어야 합니다. 샘플, 추출된 핵산 및 증폭된 PCR 산물은 이 공간에서 취급해서는 안 됩니다. 증폭 시약은 냉동고(또는 제조업체 권장 사항에 따라 냉장실)의 지정된 공간, 특히 층류 캐비닛이나 PCR 전 구역 옆에 보관해야 합니다. PCR 전 구역이나 층류 캐비닛에 들어갈 때마다 장갑을 교체해야 합니다.
PCR 전 구역 또는 층류 캐비닛은 사용 전후에 다음과 같이 청소해야 합니다. 캐비닛 내 모든 품목(예: 피펫, 팁 박스, 볼텍스, 원심분리기, 튜브 랙, 펜 등)을 70% 에탄올이나 시판 DNA 파괴 살균제로 닦고 건조시킵니다. 층류 캐비닛과 같이 밀폐된 작업 공간에서 작업하는 경우, 후드를 30분 동안 자외선에 노출시킵니다.
메모
시약을 자외선에 노출시키지 마십시오. 깨끗한 후에만 캐비닛으로 옮기십시오. 역전사 PCR을 수행하는 경우, 접촉 시 RNase를 분해하는 용액으로 표면과 장비를 닦는 것도 도움이 될 수 있습니다. 이렇게 하면 RNA 효소 분해로 인한 위음성 결과를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오염 제거 후 마스터믹스를 준비하기 전에 장갑을 한 번 더 착용하고 캐비닛을 사용할 준비를 합니다.
Pre-PCR: 핵산 추출/템플릿 추가:
핵산은 별도의 피펫, 필터 팁, 튜브 랙, 깨끗한 장갑, 실험복 및 기타 장비를 사용하여 두 번째로 지정된 구역에서 추출하고 취급해야 합니다. 이 구역은 마스터믹스 튜브 또는 플레이트에 템플릿, 대조군 및 추세선을 추가하는 데에도 사용됩니다. 분석 중인 추출된 핵산 샘플의 오염을 방지하기 위해 양성 대조군이나 표준물질을 취급하기 전에 장갑을 교체하고 별도의 피펫 세트를 사용하는 것이 좋습니다. PCR 시약 및 증폭 산물은 이 구역에서 피펫팅해서는 안 됩니다. 샘플은 같은 구역의 지정된 냉장고 또는 냉동고에 보관해야 합니다. 샘플 작업 공간은 마스터믹스 공간과 동일한 방식으로 청소해야 합니다.
PCR 후: 증폭된 생성물의 증폭 및 취급
이 지정 공간은 증폭 후 공정을 위한 공간으로, PCR 전 구역과 물리적으로 분리되어야 합니다. 일반적으로 열순환기와 실시간 플랫폼이 설치되어 있으며, 중첩 PCR을 수행하는 경우 라운드 1 PCR 생성물을 라운드 2 반응에 첨가하기 위한 층류 캐비닛을 구비하는 것이 이상적입니다. 오염 위험이 높으므로 이 구역에서는 PCR 시약과 추출된 핵산을 취급해서는 안 됩니다. 이 구역에는 별도의 장갑, 실험복, 플레이트 및 튜브 랙, 피펫, 필터 팁, 빈 및 기타 장비가 있어야 합니다. 튜브는 개봉 전에 원심분리해야 합니다. 샘플 작업 공간은 마스터믹스 공간과 동일한 방식으로 청소해야 합니다.
PCR 후: 제품 분석
이 공간은 겔 전기영동 탱크, 전원 팩, 자외선 투과조명기, 겔 문서화 시스템 등 제품 검출 장비를 위한 공간입니다. 이 공간에는 장갑, 실험복, 플레이트 및 튜브 랙, 피펫, 필터 팁, 빈, 기타 장비가 별도로 비치되어야 합니다. 로딩 염료, 분자 마커, 아가로스 겔, 완충액 성분을 제외한 다른 시약은 이 공간으로 반입할 수 없습니다. 샘플 작업 공간은 마스터믹스 공간과 동일한 방식으로 청소해야 합니다.
중요 참고 사항
이상적으로는, PCR 후 검사실에서 이미 검사를 진행한 경우, 같은 날 PCR 전 검사실에 들어가지 않는 것이 좋습니다. 만약 불가피한 경우, 먼저 손을 깨끗이 씻고 검사실 내에서는 전용 가운을 착용하십시오. PCR 후 검사실에서 사용한 검사 기록지와 서류는 PCR 전 검사실로 가져가지 마십시오. 필요한 경우, 프로토콜/검체 ID 등을 출력하여 사본을 보관하십시오.
4. 일반 분자생물학 조언
분석 방해를 방지하려면 분말이 없는 장갑을 사용하십시오. 오염을 줄이려면 올바른 피펫팅 기술이 매우 중요합니다. 잘못된 피펫팅은 액체 분주 시 액체가 튀거나 에어로졸이 생성될 수 있습니다. 올바른 피펫팅에 대한 모범 사례는 다음 링크에서 확인할 수 있습니다. Gilson 피펫팅 가이드, Anachem 피펫팅 기술 동영상, 개봉 전 튜브를 원심분리하고, 액체가 튀지 않도록 조심스럽게 개봉하십시오. 오염 물질 유입을 방지하기 위해 사용 후에는 즉시 튜브를 닫으십시오.
여러 반응을 수행할 때는 시약 교체 횟수를 최소화하고 오염 위험을 줄이기 위해 공통 시약(예: 물, dNTP, 완충액, 프라이머, 효소)을 포함하는 하나의 마스터믹스를 준비하십시오. 마스터믹스는 얼음이나 차가운 블록 위에 두는 것이 좋습니다. 핫 스타트 효소를 사용하면 비특이적 생성물 생성을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 형광 프로브가 포함된 시약은 분해를 방지하기 위해 빛으로부터 보호하십시오.
5. 내부 통제
모든 반응에는 잘 특성화되고 확인된 양성 및 음성 대조군과 함께 템플릿이 없는 대조군을 사용하고, 정량 반응에는 다점 적정 추세선을 사용합니다. 양성 대조군은 오염 위험을 초래할 정도로 강해서는 안 됩니다. 핵산 추출 시 양성 및 음성 추출 대조군을 포함합니다.
각 구역에 명확한 지침을 게시하여 사용자가 행동 규칙을 인지하도록 하는 것이 좋습니다. 임상 검체에서 매우 낮은 수준의 DNA 또는 RNA가 검출되는 진단 검사실에서는 PCR 전 검사실에는 약양압, PCR 후 검사실에는 약음압의 별도의 공기 처리 시스템을 설치하는 등 추가적인 보안 조치를 취하는 것이 좋습니다.
마지막으로, 품질 보증(QA) 계획을 수립하는 것이 좋습니다. 이러한 계획에는 시약 마스터 스톡 및 워킹 스톡 목록, 키트 및 시약 보관 규칙, 관리 결과 보고, 직원 교육 프로그램, 문제 해결 알고리즘, 그리고 필요 시 시정 조치 등이 포함되어야 합니다.
6. 참고문헌
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3장: qPCR 실험실 구축. USEPA qPCR 방법 1611을 이용한 레크리에이션용 수역 검사 지침서. 랜싱-미시간 주립대학교.
영국 공중보건국(Public Health England), NHS. 영국 미생물학 조사 표준: 분자 증폭 분석 수행 시 우수 실험실 관리 기준(Good Laboratory Practice). 품질 지침. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR 실험실 설립. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. 원심분리기의 정기 유지보수: 원심분리기, 로터 및 어댑터의 세척, 유지보수 및 소독(백서 14호). 함부르크: 에펜도르프; 2013.
Viana RV, Wallis CL. 진단 검사실에서 사용되는 분자 기반 검사를 위한 우수임상실험실관리기준(GCLP), Akyar I 편집. 광범위한 품질 관리. 크로아티아 리예카: Intech; 2011: 29–52.
게시 시간: 2020년 7월 16일
