A molekuláris detektálási módszerek képesek nagy mennyiségű nukleinsav előállítására a mintákban található nyomnyi mennyiségek amplifikálásával. Bár ez előnyös az érzékeny detektálás lehetővé tétele szempontjából, a laboratóriumi környezetben terjedő amplifikációs aeroszolok révén szennyeződés lehetőségét is magában hordozza. Kísérletek elvégzése során intézkedéseket lehet tenni a reagensek, a laboratóriumi berendezések és az asztalok szennyeződésének elkerülésére, mivel az ilyen szennyeződés álpozitív (vagy álnegatív) eredményeket eredményezhet.
A szennyeződés valószínűségének csökkentése érdekében mindenkor be kell tartani a helyes laboratóriumi gyakorlatot. Különösen a következő pontokkal kapcsolatban kell óvintézkedéseket tenni:
1. Reagensek kezelése
2. A munkaterület és a felszerelés megszervezése
3. Használati és tisztítási tanácsok a kijelölt molekuláris térhez
4. Általános molekuláris biológiai tanácsok
5. Belső ellenőrzések
6. Bibliográfia
1. Reagensek kezelése
Felnyitás előtt röviden centrifugálja a reagenscsöveket az aeroszolok képződésének elkerülése érdekében. Ossza szét a reagenseket a többszöri fagyasztás-olvadás és a törzsoldatok szennyeződésének elkerülése érdekében. Világosan címkézze fel és dátumozza meg az összes reagens- és reakciócsövet, és vezesse a kísérletekben használt reagensek tételszámát és gyártási számát. Pipettázza az összes reagenst és mintát szűrőhegyek segítségével. Vásárlás előtt tanácsos a gyártóval egyeztetni, hogy a szűrőhegyek illeszkednek-e a használandó pipetta márkájához.
2. A munkaterület és a felszerelés megszervezése
A munkaterületet úgy kell megszervezni, hogy a munkafolyam egy irányban történjen, a tiszta területektől (PCR előtti) a szennyezett területekig (PCR utáni). A következő általános óvintézkedések segítenek csökkenteni a szennyeződés esélyét. Külön kijelölt helyiségeket, vagy legalább fizikailag elkülönített területeket kell biztosítani a következőkhöz: mastermix előkészítése, nukleinsav-extrakció és DNS-templát hozzáadása, az amplifikáció és az amplifikált termék kezelése, valamint a termékelemzés, pl. gélelektroforézis.
Bizonyos körülmények között nehézkes lehet 4 különálló helyiségben dolgozni. Egy lehetséges, de kevésbé kívánatos megoldás, ha a mastermix elkészítését egy elkülönített térben, pl. egy lamináris áramlású szekrényben végezzük. Beágyazott PCR amplifikáció esetén a második körös reakcióhoz szükséges mastermix elkészítését a mastermix elkészítéséhez szükséges „tiszta” területen kell elvégezni, de az elsődleges PCR-termékkel való beoltást az amplifikációs helyiségben, és ha lehetséges, egy erre a célra szolgáló elkülönített térben (pl. egy lamináris áramlású szekrényben) kell elvégezni.
Minden helyiséghez/területhez külön, egyértelműen felcímkézett pipettákra, szűrőhegyekre, kémcsőtartókra, vortexekre, centrifugákra (ha van), tollakra, általános laboratóriumi reagensekre, laborköpenyekre és kesztyűdobozokra van szükség, amelyek a megfelelő munkaállomásokon maradnak. A kijelölt területek közötti közlekedés során kezet kell mosni, kesztyűt és laborköpenyt pedig cserélni kell. A reagenseket és az eszközöket tilos szennyezett területről tiszta területre mozgatni. Szélsőséges esetben, amikor egy reagenst vagy egy eszközt hátrafelé kell mozgatni, először 10%-os nátrium-hipoklorittal kell fertőtleníteni, majd steril vízzel le kell törölni.
Jegyzet
A 10%-os nátrium-hipoklorit oldatot naponta frissen kell elkészíteni. Fertőtlenítéshez legalább 10 perces érintkezési időt kell betartani.
Alternatív megoldásként kereskedelmi forgalomban kapható, DNS-roncsoló felületfertőtlenítőként validált termékek is használhatók, ha a helyi biztonsági ajánlások nem engedélyezik a nátrium-hipoklorit használatát, vagy ha a nátrium-hipoklorit nem alkalmas a berendezések fémes részeinek fertőtlenítésére.
Ideális esetben a személyzetnek az egyirányú munkafolyamat elvét kell követnie, és nem szabad ugyanazon a napon a szennyezett területekről (PCR után) visszamenni a tiszta területekre (PCR előtt). Előfordulhatnak azonban olyan esetek, amikor ez elkerülhetetlen. Ilyen esetben a személyzetnek alaposan kezet kell mosnia, kesztyűt kell cserélnie, a kijelölt laborköpenyt kell viselnie, és nem kell bevinnie olyan eszközöket, amelyeket később újra ki akarnak vinni a szobából, például laborkönyveket. Az ilyen ellenőrző intézkedéseket hangsúlyozni kell a molekuláris módszerekkel foglalkozó személyzeti képzés során.
Használat után a munkaterületeket 10%-os nátrium-hipoklorittal (majd steril vízzel a maradék fehérítő eltávolítása érdekében), 70%-os etanollal vagy kereskedelmi forgalomban kapható, validált, DNS-bontó fertőtlenítőszerrel kell tisztítani. Ideális esetben ultraibolya (UV) lámpákat kell felszerelni a besugárzással történő fertőtlenítés lehetővé tétele érdekében. Az UV-lámpák használatát azonban zárt munkaterületekre, például biztonsági szekrényekre kell korlátozni, hogy korlátozzuk a laboratóriumi személyzet UV-sugárzásnak való kitettségét. Kérjük, tartsa be a gyártó utasításait az UV-lámpák ápolására, szellőztetésére és tisztítására vonatkozóan, hogy a lámpák hatékonyak maradjanak.
Ha nátrium-hipoklorit helyett 70%-os etanolt használ, a fertőtlenítés befejezéséhez UV-fénnyel kell besugározni.
Ne tisztítsa a vortexet és a centrifugát nátrium-hipoklorittal; ehelyett törölje át 70%-os etanollal, és tegye ki UV-fénynek, vagy használjon kereskedelmi forgalomban kapható DNS-bontó fertőtlenítőszert. Kiömlött folyadék esetén további tisztítási tanácsokért forduljon a gyártóhoz. Ha a gyártó utasításai megengedik, a pipettákat rutinszerűen autoklávban kell sterilizálni. Ha a pipettákat nem lehet autoklávozni, elegendő 10%-os nátrium-hipoklorittal megtisztítani (majd alaposan steril vízzel letörölni), vagy kereskedelmi forgalomban kapható DNS-bontó fertőtlenítőszerrel megtisztítani, majd UV-fénynek kitenni.
A magas nátrium-hipoklorit tartalmú tisztítás rendszeres használat esetén végül károsíthatja a pipetták műanyag és fém részeit; először ellenőrizze a gyártó ajánlásait. Minden berendezést rendszeresen kalibrálni kell a gyártó által ajánlott ütemterv szerint. Egy kijelölt személynek kell felelősnek lennie a kalibrációs ütemterv betartásáért, a részletes naplók vezetéséért és a szervizcímkék jól látható helyen történő feltüntetéséért a berendezéseken.
3. Használati és tisztítási tanácsok a kijelölt molekuláris térhez
PCR előtti rész: Reagens alikvotálás / mastermix előkészítése: Ennek kell lennie a molekuláris kísérletek előkészítéséhez használt összes helyiség közül a legtisztábbnak, és ideális esetben egy erre a célra kijelölt, UV-fénnyel felszerelt lamináris áramlási fülkének kell lennie. A mintákat, a kivont nukleinsavat és az amplifikált PCR-termékeket tilos ezen a területen kezelni. Az amplifikációs reagenseket fagyasztóban (vagy hűtőszekrényben, a gyártó ajánlásai szerint) kell tárolni, ugyanabban a kijelölt helyiségben, ideális esetben a lamináris áramlási fülke vagy a PCR előtti terület mellett. A kesztyűt minden alkalommal cserélni kell, amikor belépünk a PCR előtti területre vagy a lamináris áramlási fülkébe.
A PCR előtti területet vagy a lamináris áramlású fülkét használat előtt és után az alábbiak szerint kell tisztítani: Törölje át a fülkében lévő összes tárgyat, pl. pipettákat, hegytartókat, vortex-et, centrifugát, csőtartókat, tollakat stb. 70%-os etanollal vagy kereskedelmi forgalomban kapható DNS-bontó fertőtlenítőszerrel, majd hagyja megszáradni. Zárt munkaterület, pl. lamináris áramlású fülke esetén tegye ki a fülkét UV-fénynek 30 percig.
Jegyzet
Ne tegye ki a reagenseket UV-fénynek; csak tiszta állapotban helyezze őket a szekrénybe. Reverz transzkripciós PCR elvégzése esetén hasznos lehet a felületeket és a berendezéseket olyan oldattal letörölni, amely érintkezésbe kerülve lebontja az RNázokat. Ez segíthet elkerülni az RNS enzimes lebontásából eredő álnegatív eredményeket. A fertőtlenítés után és a mastermix elkészítése előtt ismét kesztyűt kell cserélni, majd a szekrény használatra kész.
PCR előtti: Nukleinsav-kivonás/templát hozzáadása:
A nukleinsavat egy második, kijelölt területen kell kivonni és kezelni, külön pipettakészlettel, szűrőhegyekkel, csőtartókkal, tiszta kesztyűkkel, laboratóriumi köpenyekkel és egyéb felszerelésekkel. Ez a terület szolgál a templátok, a kontrollok és a trendvonalak mastermix csövekhez vagy lemezekhez való hozzáadására is. Az elemzett extrahált nukleinsavminták szennyeződésének elkerülése érdekében ajánlott a pozitív kontrollok vagy standardok kezelése előtt kesztyűt cserélni, és külön pipettakészletet használni. PCR-reagenseket és amplifikált termékeket tilos ezen a területen pipettázni. A mintákat kijelölt hűtőszekrényekben vagy fagyasztókban kell tárolni ugyanazon a területen. A minta munkaterületét ugyanúgy kell tisztítani, mint a mastermix terét.
PCR utáni: Az amplifikált termék amplifikációja és kezelése
Ez a kijelölt tér az amplifikáció utáni folyamatokra szolgál, és fizikailag elkülönülnie kell a PCR előtti területektől. Általában termociklereket és valós idejű platformokat tartalmaz, és ideális esetben egy lamináris áramlású fülkével kell rendelkeznie az 1. kör PCR-termékének a 2. kör reakciójához való hozzáadásához, ha beágyazott PCR-t végeznek. A PCR-reagenseket és a kivont nukleinsavat tilos ezen a területen kezelni, mivel magas a szennyeződés kockázata. Ezen a területen külön kesztyűkészletnek, laboratóriumi köpenynek, lemez- és csőtartóknak, pipettáknak, szűrőhegyeknek, tartályoknak és egyéb felszerelésnek kell lennie. A csöveket felbontás előtt centrifugálni kell. A minta munkaterületét ugyanúgy kell tisztítani, mint a mastermix terét.
PCR utáni: Termékelemzés
Ez a helyiség a termékdetektáló berendezéseknek van fenntartva, pl. gélelektroforézis tartályoknak, tápegységeknek, UV transzilluminátornak és a gél dokumentációs rendszerének. Ezen a területen külön kesztyűkészleteknek, laboratóriumi köpenyeknek, lemez- és csőtartóknak, pipettáknak, szűrőhegyeknek, tartályoknak és egyéb felszereléseknek kell lenniük. Semmilyen más reagens nem hozható be ebbe a területbe, kivéve a betöltő festéket, a molekuláris markert és az agaróz gélt, valamint a puffer komponenseket. A minta munkaterületét ugyanúgy kell takarítani, mint a mastermix terét.
Fontos megjegyzés
Ideális esetben a PCR előtti helyiségekbe nem szabad ugyanazon a napon belépni, ha a PCR utáni helyiségekben már végeztek munkát. Ha ez teljesen elkerülhetetlen, gondoskodjon arról, hogy először alaposan kezet mosson, és hogy a helyiségekben speciális laborköpenyt viseljen. Laboratóriumi naplókat és papírokat tilos bevinni a PCR előtti helyiségekbe, ha azokat a PCR utáni helyiségekben használták; szükség esetén készítsen másolatokat a protokollokról/mintaazonosítókról stb.
4. Általános molekuláris biológiai tanácsok
Használjon púdermentes kesztyűt a vizsgálat gátlásának elkerülése érdekében. A helyes pipettázási technika elengedhetetlen a szennyeződés csökkentéséhez. A helytelen pipettázás folyadékok adagolásakor fröccsenéshez és aeroszolok képződéséhez vezethet. A helyes pipettázásra vonatkozó jó gyakorlatok a következő linkeken találhatók: Gilson pipettázási útmutató, Anachem pipettázási technikát bemutató videók, Centrifugacsöveket nyitás előtt óvatosan nyissa ki, hogy elkerülje a fröccsenést. Használat után azonnal zárja le a csöveket a szennyeződések bejutásának elkerülése érdekében.
Több reakció végrehajtásakor készítsen egy mastermixet, amely a közös reagenseket (pl. víz, dNTP-k, puffer, primer és enzim) tartalmazza, hogy minimalizálja a reagensek átvitelének számát és csökkentse a szennyeződés veszélyét. Javasoljuk, hogy a mastermixet jégen vagy hűtőblokkban állítsa elő. A Hot Start enzim használata segíthet csökkenteni a nem specifikus termékek termelődését. A fluoreszcens próbákat tartalmazó reagenseket védje a fénytől a lebomlás elkerülése érdekében.
5. Belső ellenőrzések
Minden reakcióban használjon jól jellemzett, megerősített pozitív és negatív kontrollokat, valamint egy templát nélküli kontrollt, a kvantitatív reakciókhoz pedig egy többpontos titrálású trendvonalat. A pozitív kontroll nem lehet olyan erős, hogy szennyeződési kockázatot jelentsen. Nukleinsav-extrakció végrehajtásakor használjon pozitív és negatív extrakciós kontrollokat is.
Javasoljuk, hogy minden területen egyértelmű utasításokat helyezzenek el, hogy a felhasználók tisztában legyenek a viselkedési szabályokkal. Azoknak a diagnosztikai laboratóriumoknak, amelyek nagyon alacsony szintű DNS-t vagy RNS-t mutatnak ki klinikai mintákban, további biztonsági intézkedésként érdemes lehet külön légkezelő rendszereket alkalmazniuk enyhén pozitív légnyomással a PCR előtti, és enyhén negatív légnyomással a PCR utáni helyiségekben.
Végül hasznos egy minőségbiztosítási (QA) terv kidolgozása. Egy ilyen tervnek tartalmaznia kell a reagens törzs- és munkakészletek listáját, a készletek és reagensek tárolására vonatkozó szabályokat, az ellenőrzési eredmények jelentését, a személyzet képzési programjait, a hibaelhárítási algoritmusokat és a szükséges korrekciós intézkedéseket.
6. Bibliográfia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. fejezet: qPCR laboratórium beállítása. Útmutató a rekreációs vizek USEPA qPCR 1611 módszerrel történő vizsgálatához. Lansing-Michigani Állami Egyetem.
Public Health England, NHS. Az Egyesült Királyság mikrobiológiai vizsgálatainak szabványai: Jó laboratóriumi gyakorlat molekuláris amplifikációs vizsgálatok elvégzéséhez. Minőségi útmutató. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR laboratórium felállítása. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Centrifugák rendszeres karbantartása: centrifugák, rotorok és adapterek tisztítása, karbantartása és fertőtlenítése (14. számú tanulmány). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Helyes Klinikai Laboratóriumi Gyakorlat (GCLP) diagnosztikai laboratóriumokban alkalmazott molekuláris alapú tesztekhez. In: Akyar I, szerkesztő. A minőségellenőrzés széles spektruma. Rijeka, Horvátország: Intech; 2011: 29–52.
Közzététel ideje: 2020. július 16.
