Os métodos de detección molecular teñen a capacidade de producir un gran volume de ácido nucleico mediante a amplificación de cantidades residuais atopadas nas mostras. Aínda que isto é beneficioso para permitir unha detección sensible, tamén introduce a posibilidade de contaminación mediante a propagación de aerosois de amplificación no ambiente do laboratorio. Ao realizar experimentos, pódense tomar medidas para evitar a contaminación dos reactivos, o equipo de laboratorio e o espazo da mesa de traballo, xa que tal contaminación pode xerar resultados falsos positivos (ou falsos negativos).
Para axudar a reducir a probabilidade de contaminación, débense aplicar as Boas Prácticas de Laboratorio en todo momento. En concreto, débense tomar precaucións con respecto aos seguintes puntos:
1. Manexo de reactivos
2. Organización do espazo de traballo e do equipamento
3. Consellos de uso e limpeza para o espazo molecular designado
4. Consellos xerais de bioloxía molecular
5. Controis internos
6. Bibliografía
1. Manexo de reactivos
Centrifugar brevemente os tubos de reactivos antes de abrilos para evitar a xeración de aerosois. Alícuotar os reactivos para evitar conxelacións e desconxelacións múltiples e a contaminación das reservas mestres. Etiquetar e datar claramente todos os tubos de reactivos e reaccións e manter rexistros dos números de lote e lote de reactivos utilizados en todos os experimentos. Pipetear todos os reactivos e mostras usando puntas de filtro. Antes da compra, é recomendable confirmar co fabricante que as puntas de filtro se axustan á marca da pipeta que se vai usar.
2. Organización do espazo de traballo e do equipamento
O espazo de traballo debe organizarse para garantir que o fluxo de traballo se produza nunha soa dirección, desde as zonas limpas (antes da PCR) ata as zonas sucias (despois da PCR). As seguintes precaucións xerais axudarán a reducir a posibilidade de contaminación. Dispoñer de salas designadas separadas, ou como mínimo zonas fisicamente separadas, para: preparación da mestura maxistral, extracción de ácidos nucleicos e adición de moldes de ADN, amplificación e manipulación do produto amplificado e análise do produto, por exemplo, electroforese en xel.
Nalgúns casos, ter 4 salas separadas resulta difícil. Unha opción posible pero menos desexable é realizar a preparación da mestura mestra nunha zona de contención, por exemplo, unha cabina de fluxo laminar. No caso da amplificación por PCR aniñada, a preparación da mestura mestra para a segunda rolda de reacción debe facerse na zona "limpa" para a preparación da mestura mestra, pero a inoculación co produto da PCR primario debe facerse na sala de amplificación e, se é posible, nunha zona de contención específica (por exemplo, unha cabina de fluxo laminar).
Cada sala/zona necesita un conxunto separado de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, vórtices, centrífugas (se é o caso), bolígrafos, reactivos de laboratorio xenéricos, batas de laboratorio e caixas de luvas claramente etiquetados que permanecerán nos seus respectivos postos de traballo. Débense lavar as mans e cambiar as luvas e as batas de laboratorio ao moverse entre as zonas designadas. Os reactivos e o equipo non se deben mover dunha zona sucia a unha zona limpa. No caso extremo no que un reactivo ou unha peza do equipo teña que moverse cara atrás, primeiro debe descontaminarse con hipoclorito de sodio ao 10 % e, a continuación, limparse con auga estéril.
Nota
A solución de hipoclorito de sodio ao 10 % debe prepararse fresca diariamente. Cando se utilice para a descontaminación, débese respectar un tempo de contacto mínimo de 10 minutos.
Alternativamente, pódense empregar produtos dispoñibles comercialmente que estean validados como descontaminantes superficiais que destrúen o ADN se as recomendacións de seguridade locais non permiten o uso de hipoclorito de sodio ou se o hipoclorito de sodio non é axeitado para descontaminar as partes metálicas dos equipos.
Idealmente, o persoal debería respectar os principios do fluxo de traballo unidireccional e non volver das zonas sucias (despois da PCR) ás zonas limpas (antes da PCR) o mesmo día. Non obstante, pode haber ocasións nas que isto sexa inevitable. Cando xurda tal ocasión, o persoal debe ter coidado de lavarse ben as mans, cambiarse as luvas, usar a bata de laboratorio asignada e non introducir ningún equipo que queira sacar da sala de novo, como libros de laboratorio. Estas medidas de control deberían ser feitas fincapé na formación do persoal sobre métodos moleculares.
Despois do uso, os espazos da mesa de traballo deben limparse con hipoclorito de sodio ao 10 % (seguido de auga estéril para eliminar a lixivia residual), etanol ao 70 % ou un descontaminante validado que destrúa o ADN e que estea dispoñible comercialmente. O ideal é instalar lámpadas ultravioleta (UV) para permitir a descontaminación por irradiación. Non obstante, o uso de lámpadas UV debe restrinxirse a zonas de traballo pechadas, por exemplo, armarios de seguridade, para limitar a exposición do persoal do laboratorio aos raios UV. Siga as instrucións do fabricante para o coidado, a ventilación e a limpeza das lámpadas UV para garantir que as lámpadas sigan sendo eficaces.
Se se usa etanol ao 70 % en lugar de hipoclorito de sodio, será necesaria a irradiación con luz ultravioleta para completar a descontaminación.
Non limpe o vórtice nin a centrifugadora con hipoclorito de sodio; no seu lugar, limpe con etanol ao 70 % e expoña á luz ultravioleta ou use un descontaminante comercial que destrúa o ADN. En caso de derrames, consulte co fabricante para obter máis consellos de limpeza. Se as instrucións do fabricante o permiten, as pipetas deben esterilizarse de forma rutineira en autoclave. Se as pipetas non se poden esterilizar en autoclave, debería ser suficiente limpas con hipoclorito de sodio ao 10 % (seguido dunha limpeza completa con auga estéril) ou cun descontaminante comercial que destrúa o ADN seguido de exposición aos raios UV.
A limpeza con hipoclorito de sodio en alta porcentaxe pode danar os plásticos e metais das pipetas se se realiza regularmente; consulte primeiro as recomendacións do fabricante. Todo o equipo debe calibrarse regularmente segundo o programa recomendado polo fabricante. Unha persoa designada debe encargarse de garantir que se cumpra o programa de calibración, que se manteñan rexistros detallados e que as etiquetas de servizo se mostren claramente no equipo.
3. Consellos de uso e limpeza para o espazo molecular designado
Pre-PCR: Alícuota de reactivos / preparación da mestura maxistral: Este debería ser o espazo máis limpo de todos os empregados para a preparación de experimentos moleculares e, idealmente, debería ser unha cabina de fluxo laminar designada equipada cunha luz UV. As mostras, os ácidos nucleicos extraídos e os produtos de PCR amplificados non se deben manipular nesta zona. Os reactivos de amplificación deben gardarse nun conxelador (ou frigorífico, segundo as recomendacións do fabricante) no mesmo espazo designado, idealmente xunto á cabina de fluxo laminar ou á zona de pre-PCR. As luvas deben cambiarse cada vez que se entre na zona de pre-PCR ou na cabina de fluxo laminar.
A área de pre-PCR ou a cámara de fluxo laminar debe limparse antes e despois do seu uso do seguinte xeito: limpe todos os elementos da cámara, por exemplo, pipetas, caixas de puntas, vórtice, centrífuga, gradillas de tubos, bolígrafos, etc., con etanol ao 70 % ou un descontaminante comercial que destrúa o ADN e deixe secar. No caso dunha área de traballo pechada, por exemplo, unha cámara de fluxo laminar, expón a campá á luz ultravioleta durante 30 minutos.
Nota
Non expoñas os reactivos á luz ultravioleta; só os metas no armario unha vez que estea limpo. Se realizas unha PCR con transcrición inversa, tamén pode ser útil limpar as superficies e o equipo cunha solución que descompoña as ARNases ao contacto. Isto pode axudar a evitar resultados falsos negativos por degradación encimática do ARN. Despois da descontaminación e antes de preparar a mestura maxistral, as luvas deben cambiarse unha vez máis e, a continuación, o armario estará listo para o seu uso.
Pre-PCR: Extracción de ácidos nucleicos/adición de molde:
O ácido nucleico debe extraerse e manipularse nunha segunda zona designada, empregando un conxunto separado de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, luvas novas, batas de laboratorio e outros equipos. Esta zona tamén se utiliza para engadir moldes, controis e liñas de tendencia aos tubos ou placas de mestura maxistral. Para evitar a contaminación das mostras de ácido nucleico extraídas que se analizan, recoméndase cambiar as luvas antes de manipular controis ou estándares positivos e empregar un conxunto separado de pipetas. Os reactivos de PCR e os produtos amplificados non se deben pipetear nesta zona. As mostras deben almacenarse en frigoríficos ou conxeladores designados na mesma zona. O espazo de traballo da mostra debe limparse do mesmo xeito que o espazo da mestura maxistral.
Post-PCR: Amplificación e manipulación do produto amplificado
Este espazo designado é para procesos de postamplificación e debe estar fisicamente separado das áreas de prePCR. Normalmente contén termocicladores e plataformas en tempo real, e idealmente debería ter unha cabina de fluxo laminar para engadir o produto da PCR da rolda 1 á reacción da rolda 2, se se está a realizar unha PCR aniñada. Os reactivos da PCR e o ácido nucleico extraído non se deben manipular nesta área, xa que o risco de contaminación é alto. Esta área debe ter un conxunto separado de luvas, batas de laboratorio, gradillas para placas e tubos, pipetas, puntas de filtro, recipientes e outros equipos. Os tubos deben centrifugarse antes de abrirse. O espazo de traballo da mostra debe limparse do mesmo xeito que o espazo da mestura maxistral.
Pos-PCR: análise do produto
Esta sala é para equipos de detección de produtos, por exemplo, tanques de electroforese en xel, baterías de litio, transiluminador UV e o sistema de documentación do xel. Esta área debe ter conxuntos separados de luvas, batas de laboratorio, gradillas para placas e tubos, pipetas, puntas de filtro, recipientes e outros equipos. Non se poden introducir outros reactivos nesta área, agás o colorante de carga, o marcador molecular e o xel de agarosa, e os compoñentes do tampón. O espazo de traballo da mostra debe limparse do mesmo xeito que o espazo da mestura maxistral.
Nota importante
O ideal é non entrar nas salas de pre-PCR o mesmo día se xa se traballou nas salas de pos-PCR. Se isto é completamente inevitable, asegúrese de lavar ben as mans primeiro e de usar batas de laboratorio específicas nas salas. Non se deben introducir libros nin documentos de laboratorio nas salas de pre-PCR se se utilizaron nas salas de pos-PCR; se é necesario, faga copias impresas dos protocolos/ID de mostras, etc.
4. Consellos xerais de bioloxía molecular
Use luvas sen po para evitar a inhibición do ensaio. A técnica correcta de pipeteado é fundamental para reducir a contaminación. Un pipeteado incorrecto pode provocar salpicaduras ao dispensar líquidos e a creación de aerosois. As boas prácticas para un pipeteado correcto pódense atopar nas seguintes ligazóns: Guía de pipeteado de Gilson, vídeos da técnica de pipeteado de Anachem, tubos de centrifugación antes de abrir e ábraos con coidado para evitar salpicaduras. Peche os tubos inmediatamente despois do seu uso para evitar a introdución de contaminantes.
Ao realizar varias reaccións, prepare unha mestura mestra que conteña reactivos comúns (por exemplo, auga, dNTP, tampón, cebadores e encima) para minimizar o número de transferencias de reactivos e reducir a ameaza de contaminación. Recoméndase preparar a mestura mestra en xeo ou nun bloque frío. O uso dun encima de inicio en quente pode axudar a reducir a produción de produtos non específicos. Protexa os reactivos que conteñan sondas fluorescentes da luz para evitar a degradación.
5. Controis internos
Incluír controis positivos e negativos ben caracterizados e confirmados, xunto cun control sen molde en todas as reaccións e unha liña de tendencia titulada en varios puntos para as reaccións cuantitativas. O control positivo non debe ser tan forte que supoña un risco de contaminación. Inclúa controis de extracción positivos e negativos ao realizar a extracción de ácidos nucleicos.
Recoméndase colocar instrucións claras en cada unha das zonas para que os usuarios coñezan as normas de conduta. Os laboratorios de diagnóstico que detecten niveis moi baixos de ADN ou ARN en mostras clínicas poden querer adoptar a medida de seguridade adicional de ter sistemas de tratamento de aire separados con presión de aire lixeiramente positiva nas salas previas á PCR e presión de aire lixeiramente negativa nas salas posteriores á PCR.
Por último, resulta útil desenvolver un plan de garantía de calidade (GC). Este plan debería incluír listas de existencias maestras de reactivos e de traballo, normas para o almacenamento de kits e reactivos, a notificación dos resultados dos controis, programas de formación do persoal, algoritmos de resolución de problemas e accións correctivas cando sexa necesario.
6. Bibliografía
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capítulo 3: Configuración dun laboratorio de qPCR. Un documento de orientación para analizar augas recreativas usando o método qPCR 1611 da USEPA. Lansing- Universidade Estatal de Michigan.
Public Health England, NHS. Normas do Reino Unido para investigacións microbiolóxicas: Boas prácticas de laboratorio ao realizar ensaios de amplificación molecular. Guía de calidade. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Configuración dun laboratorio de PCR. Cold Spring Harb Protocol. 2007;7.
Schroeder S 2013. Mantemento rutinario de centrífugas: limpeza, mantemento e desinfección de centrífugas, rotores e adaptadores (Libro técnico n.º 14). Hamburgo: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Boas prácticas de laboratorio clínico (GCLP) para probas moleculares utilizadas en laboratorios de diagnóstico, En: Akyar I, editor. Amplos espectros de control de calidade. Rijeka, Croacia: Intech; 2011: 29–52.
Data de publicación: 16 de xullo de 2020
