Molekulaarsed detekteerimismeetodid suudavad toota suures koguses nukleiinhappeid proovides leiduvate mikrokoguste amplifikatsiooni teel. Kuigi see on kasulik tundliku detekteerimise võimaldamiseks, tekitab see ka saastumise võimaluse amplifikatsiooniaerosoolide leviku kaudu laborikeskkonnas. Katsete läbiviimisel saab võtta meetmeid reagentide, laboriseadmete ja tööpinna saastumise vältimiseks, kuna selline saastumine võib anda valepositiivseid (või valenegatiivseid) tulemusi.
Saastumise tõenäosuse vähendamiseks tuleks alati järgida häid laboritavasid. Täpsemalt tuleks ettevaatusabinõusid võtta järgmiste punktide osas:
1. Reagentide käsitsemine
2. Tööruumi ja seadmete korraldus
3. Molekulaarse ruumi kasutamise ja puhastamise juhised
4. Üldised molekulaarbioloogia nõuanded
5. Sisekontroll
6. Bibliograafia
1. Reagentide käsitsemine
Tsentrifuugige reagendituube enne avamist lühidalt, et vältida aerosoolide teket. Jagage reagendid alikvootideks, et vältida mitmekordset külmutamist-sulatamist ja baaslahuste saastumist. Märgistage ja dateerige selgelt kõik reagendi- ja reaktsioonituubid ning pidage logisid kõigis katsetes kasutatud reagentide partii- ja seerianumbrite kohta. Pipeteerige kõik reagendid ja proovid filterotsikute abil. Enne ostmist on soovitatav tootjaga kinnitada, et filterotsad sobivad kasutatava pipeti kaubamärgiga.
2. Tööruumi ja seadmete korraldus
Tööruum tuleks korraldada nii, et töövoog toimuks ühes suunas, puhastest aladest (enne PCR-i) mustadesse aladesse (pärast PCR-i). Järgmised üldised ettevaatusabinõud aitavad vähendada saastumise võimalust. Kasutage eraldi määratud ruume või vähemalt füüsiliselt eraldatud alasid järgmiste toimingute jaoks: mastermix'i ettevalmistamine, nukleiinhapete ekstraheerimine ja DNA matriitsi lisamine, amplifitseeritud produkti amplifitseerimine ja käitlemine ning produkti analüüs, nt geelelektroforees.
Mõnes keskkonnas on nelja eraldi ruumi omamine keeruline. Võimalik, kuid vähem soovitav variant on teha mastermix'i ettevalmistamine isoleeritud alal, nt laminaarse voolu kapis. Pesastatud PCR amplifikatsiooni korral tuleks teise vooru reaktsiooniks mastermix'i ettevalmistamine teha mastermix'i ettevalmistamise „puhtas“ alal, kuid primaarse PCR-produktiga inokuleerimine tuleks teha amplifikatsiooniruumis ja võimalusel spetsiaalses isoleeritud alal (nt laminaarse voolu kapis).
Igas ruumis/alal on vaja eraldi komplekti selgelt märgistatud pipette, filtriotsikuid, katseklaasialuseid, keeriseid, tsentrifuuge (vajadusel), pastakaid, üldotstarbelisi laborireagente, laborikitleid ja kindakarpe, mis jäävad vastavatesse tööjaamadesse. Määratud alade vahel liikudes tuleb käsi pesta ning kindaid ja laborikitleid vahetada. Reagente ja seadmeid ei tohiks määrdunud alalt puhtasse alale viia. Äärmuslikul juhul, kui reagenti või seadet on vaja tagurpidi liigutada, tuleb see kõigepealt dekontamineerida 10% naatriumhüpokloritiga ja seejärel steriilse veega pühkida.
Märkus
10% naatriumhüpokloriti lahust tuleb iga päev värskelt valmistada. Dekontaminatsiooniks kasutamisel tuleb kinni pidada minimaalsest kokkupuuteajast 10 minutit.
Teise võimalusena võib kasutada kaubanduslikult saadaval olevaid tooteid, mis on valideeritud DNA-d lagundavate pinnapuhastusvahenditena, kui kohalikud ohutusnõuded ei luba naatriumhüpokloriti kasutamist või kui naatriumhüpoklorit ei sobi seadmete metallosade puhastamiseks.
Ideaalis peaksid töötajad järgima ühesuunalise töövoo põhimõtet ega tohiks samal päeval määrdunud alalt (pärast PCR-i) tagasi puhastesse aladesse (enne PCR-i) minna. Siiski võib esineda olukordi, kus see on vältimatu. Sellisel juhul peavad töötajad hoolikalt käsi pesema, kindaid vahetama, kandma ettenähtud laborikitlit ja mitte tooma ruumist välja vahendeid, näiteks laboriraamatuid. Selliseid kontrollimeetmeid tuleks molekulaarsete meetodite alase personalikoolituse käigus rõhutada.
Pärast kasutamist tuleks tööpinnad puhastada 10% naatriumhüpokloritiga (millele järgneb steriilse veega pleegitusjääkide eemaldamine), 70% etanooliga või valideeritud kaubanduslikult saadaoleva DNA-d lagundava dekontamineerimisvahendiga. Ideaalis tuleks paigaldada ultraviolettlambid (UV-lambid), mis võimaldavad dekontaminatsiooni kiiritamise teel. UV-lampide kasutamine peaks aga piirduma suletud tööruumidega, nt ohutuskappides, et piirata laboripersonali kokkupuudet UV-kiirgusega. Palun järgige tootja juhiseid UV-lampide hooldamise, ventilatsiooni ja puhastamise kohta, et tagada lampide efektiivsus.
Kui naatriumhüpokloriti asemel kasutatakse 70% etanooli, on dekontaminatsiooni lõpuleviimiseks vaja kiiritada UV-valgusega.
Ärge puhastage keerist ja tsentrifuugi naatriumhüpokloritiga; pühkige selle asemel 70% etanooliga ja hoidke UV-valguses või kasutage kaubanduslikku DNA-d lagundavat dekontaminanti. Lekke korral pöörduge tootja poole täiendavate puhastamisjuhiste saamiseks. Kui tootja juhised seda lubavad, tuleks pipette regulaarselt autoklaaviga steriliseerida. Kui pipette ei saa autoklaavida, peaks piisama nende puhastamisest 10% naatriumhüpokloritiga (millele järgneb põhjalik pühkimine steriilse veega) või kaubandusliku DNA-d lagundava dekontaminantiga ja seejärel UV-kiirgusega töötlemine.
Kõrge naatriumhüpokloriti sisaldusega puhastamine võib regulaarsel kasutamisel pipeti plast- ja metallosasid kahjustada; kõigepealt tutvuge tootja soovitustega. Kõiki seadmeid tuleb regulaarselt kalibreerida vastavalt tootja soovitatud ajakavale. Kalibreerimisgraafiku järgimise, üksikasjalike logide pidamise ja seadmetel selgelt nähtavate hooldussiltide eest vastutav isik peaks vastutama.
3. Molekulaarse ruumi kasutamise ja puhastamise juhised
Pre-PCR: Reagentide alikvootimine / mastermix'i ettevalmistamine: See peaks olema molekulaarkatsete ettevalmistamiseks kasutatavatest ruumidest kõige puhtam ja ideaaljuhul peaks see olema UV-valgusega varustatud laminaarvoolukapp. Proove, ekstraheeritud nukleiinhappeid ja amplifitseeritud PCR-produkte ei tohi selles alas käsitseda. Amplifikatsioonireagente tuleks hoida sügavkülmikus (või külmkapis vastavalt tootja soovitustele) samas selleks ettenähtud ruumis, ideaaljuhul laminaarvoolukapi või pre-PCR-ala kõrval. Kindaid tuleks iga kord pre-PCR-alale või laminaarvoolukappi sisenemisel vahetada.
PCR-eelset ala või laminaarvoolukappi tuleks enne ja pärast kasutamist puhastada järgmiselt: pühkige kõik kapis olevad esemed, nt pipetid, otsikukarbid, keerissegisti, tsentrifuug, katseklaaside alused, pastakad jne 70% etanooli või kaubandusliku DNA-d lagundava dekontaminatsioonivahendiga ja laske kuivada. Suletud tööala, nt laminaarvoolukapi puhul asetage kapuuts 30 minutiks UV-valguse kätte.
Märkus
Ärge jätke reagente UV-valguse kätte; pange need kappi alles siis, kui see on puhas. Pöördtranskriptsiooni PCR-i läbiviimisel võib olla kasulik pindade ja seadmete pühkimine lahusega, mis lagundab kokkupuutel RNaase. See võib aidata vältida RNA ensüümilise lagundamise tõttu vale-negatiivseid tulemusi. Pärast dekontaminatsiooni ja enne mastermigu valmistamist tuleks kindaid veel kord vahetada ja seejärel on kapp kasutusvalmis.
Pre-PCR: Nukleiinhappe ekstraheerimine/matriitsi lisamine:
Nukleiinhapet tuleb ekstraheerida ja käsitseda teises selleks ettenähtud alas, kasutades eraldi pipette, filtriotsikuid, katseklaasialuseid, uusi kindaid, laborikitleid ja muud varustust. See ala on mõeldud ka malli, kontrollide ja trendijoonte lisamiseks mastermix-katsutitesse või -plaatidele. Ekstraheeritud nukleiinhappeproovide saastumise vältimiseks analüüsimisel on soovitatav enne positiivsete kontrollide või standardite käitlemist kindaid vahetada ja kasutada eraldi pipette. PCR-reagente ja amplifitseeritud saadusi ei tohi sellesse alasse pipeteerida. Proove tuleks hoida samas piirkonnas asuvates ettenähtud külmikutes või sügavkülmikutes. Proovide tööruum tuleks puhastada samamoodi nagu mastermix-ruum.
Pärast PCR-i: amplifitseeritud produkti amplifikatsioon ja käitlemine
See määratud ruum on ette nähtud amplifikatsioonijärgseteks protsessideks ja peaks olema füüsiliselt eraldatud PCR-eelsetest aladest. Tavaliselt sisaldavad see termotsüklereid ja reaalajas platvorme ning ideaaljuhul peaks seal olema laminaarse vooluga kapp 1. vooru PCR-produkti lisamiseks 2. vooru reaktsiooni, kui tehakse nested PCR-i. PCR-reagente ja ekstraheeritud nukleiinhapet ei tohi selles alas käidelda, kuna saastumisoht on suur. Selles alas peaks olema eraldi komplekt kindaid, laborikitleid, plaadi- ja katseklaasialuseid, pipette, filtriotsikuid, prügikaste ja muud varustust. Katsutid tuleb enne avamist tsentrifuugida. Proovi tööruum tuleks puhastada samamoodi nagu mastermigaas.
Pärast PCR-i: tooteanalüüs
See ruum on mõeldud toote tuvastamise seadmete jaoks, nt geelelektroforeesi mahutid, toiteplokid, UV-transilluminaator ja geeli dokumenteerimissüsteem. Selles alas peaksid olema eraldi kinnaste komplektid, laborikitlid, plaatide ja katseklaaside hoidikud, pipetid, filtriotsad, prügikastid ja muu varustus. Sellesse alasse ei tohi tuua muid reagente, välja arvatud laadimisvärv, molekulaarne marker ja agaroosgeel ning puhverkomponendid. Proovi tööruum tuleks puhastada samamoodi nagu mastermigaat.
Oluline märkus
Ideaalis ei tohiks PCR-eelsetesse ruumidesse siseneda samal päeval, kui PCR-järgsetes ruumides on juba tööd tehtud. Kui see on täiesti vältimatu, tuleb kõigepealt veenduda, et käed pestakse hoolikalt ja ruumides kantakse spetsiaalseid laborikitleid. Laboripäevikuid ja -dokumente ei tohi PCR-eelsetesse ruumidesse kaasa võtta, kui neid on PCR-järgsetes ruumides kasutatud; vajadusel tehke protokollide/proovi ID-de jms koopiad.
4. Üldised molekulaarbioloogia nõuanded
Kasutage pulverivabu kindaid, et vältida analüüsi inhibeerimist. Õige pipeteerimistehnika on saastumise vähendamisel ülioluline. Vale pipeteerimine võib vedelike väljastamisel põhjustada pritsimist ja aerosoolide teket. Hea tava õigeks pipeteerimiseks leiate järgmistelt linkidelt: Gilsoni pipeteerimisjuhend, Anachemi pipeteerimistehnika videod, Tsentrifuugitorud enne avamist ja avage need ettevaatlikult, et vältida pritsimist. Sulgege torud kohe pärast kasutamist, et vältida saasteainete sattumist organismi.
Mitme reaktsiooni läbiviimisel valmistage ette üks mastermix, mis sisaldab tavalisi reagente (nt vesi, dNTP-d, puhver, praimerid ja ensüüm), et minimeerida reagentide ülekannete arvu ja vähendada saastumisohtu. Soovitatav on mastermix ette valmistada jääl või külmas blokis. Kuumkäivituse ensüümi kasutamine võib aidata vähendada mittespetsiifiliste toodete tootmist. Kaitske fluorestseeruvaid sonde sisaldavaid reagente valguse eest, et vältida lagunemist.
5. Sisekontroll
Kõigis reaktsioonides kasutage hästi iseloomustatud ja kinnitatud positiivseid ja negatiivseid kontrolle ning matriitsita kontrolli ning kvantitatiivsete reaktsioonide jaoks mitmepunktiliselt tiitritud trendijoont. Positiivne kontroll ei tohiks olla nii tugev, et see tekitaks saastumisohtu. Nukleiinhapete ekstraheerimisel lisage nii positiivsed kui ka negatiivsed ekstraheerimiskontrollid.
Soovitatav on igasse piirkonda üles panna selged juhised, et kasutajad oleksid käitumisreeglitest teadlikud. Diagnostilised laborid, mis tuvastavad kliinilistes proovides väga madalat DNA või RNA taset, võivad soovida võtta täiendava turvameetmena kasutusele eraldi õhukäitlussüsteemid, millel on PCR-eelsetes ruumides kergelt positiivne õhurõhk ja PCR-järgsetes ruumides kergelt negatiivne õhurõhk.
Lõpuks on kasulik välja töötada kvaliteedi tagamise (QA) plaan. Selline plaan peaks sisaldama reagentide põhivarude ja töövarude loendeid, komplektide ja reagentide säilitamise reegleid, kontrollitulemuste aruandlust, personali koolitusprogramme, tõrkeotsingu algoritme ja vajadusel parandusmeetmeid.
6. Bibliograafia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. peatükk: qPCR-labori loomine. Juhenddokument puhkealade veekogude testimiseks USEPA qPCR-meetodi 1611 abil. Lansing-Michigani Riiklik Ülikool.
Public Health England, NHS. Ühendkuningriigi mikrobioloogiliste uuringute standardid: Hea laboritava molekulaarse amplifikatsioonianalüüside tegemisel). Kvaliteedijuhis. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR-labori loomine. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Tsentrifuugide rutiinne hooldus: tsentrifuugide, rootorite ja adapterite puhastamine, hooldus ja desinfitseerimine (valge raamat nr 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Hea kliiniline laboritava (GCLP) diagnostilistes laborites kasutatavate molekulaarsete testide jaoks. Teoses: Akyar I, toimetaja. Kvaliteedikontrolli lai spekter. Rijeka, Horvaatia: Intech; 2011: 29–52.
Postituse aeg: 16. juuli 2020
