Mae gan ddulliau canfod moleciwlaidd y gallu i gynhyrchu cyfaint mawr o asid niwclëig trwy fwyhau meintiau hybrin a geir mewn samplau. Er bod hyn yn fuddiol ar gyfer galluogi canfod sensitif, mae hefyd yn cyflwyno'r posibilrwydd o halogiad trwy ledaenu aerosolau mwyhau yn amgylchedd y labordy. Wrth gynnal arbrofion, gellir cymryd mesurau i osgoi halogiad adweithyddion, offer labordy a gofod mainc, gan y gall halogiad o'r fath gynhyrchu canlyniadau positif-ffug (neu negatif-ffug).
Er mwyn helpu i leihau'r tebygolrwydd o halogiad, dylid arfer Arfer Labordy Da bob amser. Yn benodol, dylid cymryd rhagofalon ynghylch y pwyntiau canlynol:
1. Trin adweithyddion
2. Trefniadaeth y gweithle a'r offer
3. Cyngor defnyddio a glanhau ar gyfer y gofod moleciwlaidd dynodedig
4. Cyngor cyffredinol ar fioleg foleciwlaidd
5. Rheolaethau mewnol
6. Llyfryddiaeth
1. Trin adweithyddion
Allgyrchwch diwbiau adweithydd yn fyr cyn eu hagor i osgoi cynhyrchu aerosolau. Rhannwch adweithyddion yn aliquot i osgoi rhewi-dadmer lluosog a halogi'r prif stociau. Labelwch a dyddiwch yr holl diwbiau adweithydd ac adwaith yn glir a chadwch logiau o rifau swp a swp yr adweithyddion a ddefnyddir ym mhob arbrawf. Pipetiwch yr holl adweithyddion a samplau gan ddefnyddio awgrymiadau hidlo. Cyn prynu, mae'n ddoeth cadarnhau gyda'r gwneuthurwr bod yr awgrymiadau hidlo yn ffitio'r brand o bibed i'w ddefnyddio.
2. Trefniadaeth y gweithle a'r offer
Dylid trefnu'r gweithle i sicrhau bod llif y gwaith yn digwydd i un cyfeiriad, o ardaloedd glân (cyn PCR) i ardaloedd budr (ar ôl PCR). Bydd y rhagofalon cyffredinol canlynol yn helpu i leihau'r siawns o halogiad. Cael ystafelloedd dynodedig ar wahân, neu o leiaf ardaloedd ar wahân yn gorfforol, ar gyfer: paratoi cymysgedd meistr, echdynnu asid niwclëig ac ychwanegu templed DNA, ymhelaethu a thrin cynnyrch wedi'i ymhelaethu, a dadansoddi cynnyrch, e.e. electrofforesis gel.
Mewn rhai lleoliadau, mae cael 4 ystafell ar wahân yn anodd. Opsiwn posibl ond llai dymunol yw paratoi'r cymysgedd meistr mewn ardal gynnwys, e.e. cabinet llif laminar. Yn achos ymhelaethiad PCR nythu, dylid paratoi'r cymysgedd meistr ar gyfer yr ail rownd o adwaith yn yr ardal 'lân' ar gyfer paratoi'r cymysgedd meistr, ond dylid gwneud y brechiad â'r cynnyrch PCR cynradd yn yr ystafell ymhelaethiad, ac os yn bosibl mewn ardal gynnwys bwrpasol (e.e. cabinet llif laminar).
Mae angen set ar wahân o bibedi, pennau hidlo, rheseli tiwbiau, fortecsau, allgyrchyddion (os yw'n berthnasol), pennau, adweithyddion labordy generig, cotiau labordy a blychau o fenig a fydd yn aros yn eu gorsafoedd gwaith priodol ar bob ystafell/ardal. Rhaid golchi dwylo a newid menig a chotiau labordy wrth symud rhwng yr ardaloedd dynodedig. Ni ddylid symud adweithyddion ac offer o ardal fudr i ardal lân. Os bydd achos eithafol yn codi lle mae angen symud adweithydd neu ddarn o offer yn ôl, rhaid ei ddadlygru yn gyntaf â 10% hypoclorit sodiwm, ac yna ei sychu â dŵr di-haint.
Nodyn
Rhaid gwneud y toddiant hypoclorit sodiwm 10% yn ffres bob dydd. Pan gaiff ei ddefnyddio ar gyfer dadhalogi, dylid cadw at o leiaf 10 munud o amser cyswllt.
Fel arall, gellir defnyddio cynhyrchion sydd ar gael yn fasnachol sydd wedi'u dilysu fel dadhalogi arwynebau sy'n dinistrio DNA os nad yw argymhellion diogelwch lleol yn caniatáu defnyddio sodiwm hypoclorit neu os nad yw sodiwm hypoclorit yn addas ar gyfer dadhalogi rhannau metelaidd offer.
Yn ddelfrydol, dylai staff lynu wrth ethos llif gwaith unffordd a pheidio â mynd o ardaloedd budr (ar ôl PCR) yn ôl i ardaloedd glân (cyn PCR) ar yr un diwrnod. Fodd bynnag, efallai y bydd achlysuron pan na ellir osgoi hyn. Pan fydd achlysur o'r fath yn codi, rhaid i bersonél ofalu eu bod yn golchi dwylo'n drylwyr, yn newid menig, yn defnyddio'r got labordy ddynodedig ac yn peidio â chyflwyno unrhyw offer y byddant am ei gymryd allan o'r ystafell eto, fel llyfrau labordy. Dylid pwysleisio mesurau rheoli o'r fath mewn hyfforddiant staff ar ddulliau moleciwlaidd.
Ar ôl eu defnyddio, dylid glanhau mannau mainc gyda 10% o hypoclorit sodiwm (ac yna dŵr di-haint i gael gwared ar gannydd gweddilliol), 70% ethanol, neu ddadheintydd dinistrio DNA sydd wedi'i ddilysu ac sydd ar gael yn fasnachol. Yn ddelfrydol, dylid gosod lampau uwchfioled (UV) i alluogi dadheintio trwy arbelydru. Fodd bynnag, dylid cyfyngu'r defnydd o lampau UV i fannau gwaith caeedig, e.e. cypyrddau diogelwch, er mwyn cyfyngu ar amlygiad UV staff y labordy. Dilynwch gyfarwyddiadau'r gwneuthurwr ar gyfer gofalu am lampau UV, awyru a glanhau er mwyn sicrhau bod y lampau'n parhau i fod yn effeithiol.
Os ydych chi'n defnyddio ethanol 70% yn lle sodiwm hypoclorit, bydd angen arbelydru â golau UV i gwblhau'r dadhalogi.
Peidiwch â glanhau'r fortecs a'r allgyrchydd â sodiwm hypoclorit; yn lle hynny, sychwch â 70% ethanol a'i amlygu i olau UV, neu defnyddiwch ddadheintydd masnachol sy'n dinistrio DNA. Ar gyfer gollyngiadau, gwiriwch gyda'r gwneuthurwr am gyngor glanhau pellach. Os yw cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr yn caniatáu hynny, dylid sterileiddio pipetau'n rheolaidd trwy awtoclaf. Os na ellir awtoclafio pipetau, dylai fod yn ddigon eu glanhau â 10% sodiwm hypoclorit (ac yna eu sychu'n drylwyr â dŵr di-haint) neu â dadheintydd masnachol sy'n dinistrio DNA ac yna eu hamlygu i UV.
Gall glanhau â hypoclorit sodiwm canran uchel niweidio plastigau a metelau piped yn y pen draw os caiff ei wneud yn rheolaidd; gwiriwch argymhellion y gwneuthurwr yn gyntaf. Mae angen calibro'r holl offer yn rheolaidd yn unol â'r amserlen a argymhellir gan y gwneuthurwr. Dylai person dynodedig fod yn gyfrifol am sicrhau bod yr amserlen calibro yn cael ei dilyn, bod logiau manwl yn cael eu cynnal, a bod labeli gwasanaeth yn cael eu harddangos yn glir ar offer.
3. Cyngor defnyddio a glanhau ar gyfer y gofod moleciwlaidd dynodedig
Cyn-PCR: Rhannu adweithyddion / paratoi cymysgedd meistr: Dylai hwn fod y glanaf o'r holl fannau a ddefnyddir ar gyfer paratoi arbrofion moleciwlaidd ac yn ddelfrydol dylai fod yn gabinet llif laminar dynodedig sydd â golau UV. Ni ddylid trin samplau, asid niwclëig a echdynnwyd a chynhyrchion PCR wedi'u hymhelaethu yn yr ardal hon. Dylid cadw adweithyddion ymhelaethu mewn rhewgell (neu oergell, yn unol ag argymhellion y gwneuthurwr) yn yr un lle dynodedig, yn ddelfrydol wrth ymyl y cabinet llif laminar neu'r ardal cyn-PCR. Dylid newid menig bob tro wrth fynd i mewn i'r ardal cyn-PCR neu'r cabinet llif laminar.
Dylid glanhau'r ardal cyn-PCR neu'r cabinet llif laminar cyn ac ar ôl ei ddefnyddio fel a ganlyn: Sychwch bob eitem yn y cabinet, e.e. pipetau, blychau tip, fortecs, allgyrchydd, rheseli tiwbiau, pennau, ac ati gydag ethanol 70% neu ddadheintydd masnachol sy'n dinistrio DNA, a gadewch iddo sychu. Yn achos ardal waith gaeedig, e.e. cabinet llif laminar, amlygwch y cwfl i olau UV am 30 munud.
Nodyn
Peidiwch ag amlygu adweithyddion i olau UV; dim ond eu symud i'r cabinet ar ôl iddo fod yn lân. Os ydych chi'n cynnal PCR trawsgrifio gwrthdro, gall fod yn ddefnyddiol hefyd sychu arwynebau ac offer gyda thoddiant sy'n chwalu RNases wrth ddod i gysylltiad ag ef. Gall hyn helpu i osgoi canlyniadau negatif ffug o ganlyniad i ddiraddio RNA gan ensymau. Ar ôl dadhalogi a chyn paratoi'r cymysgedd meistr, dylid newid menig unwaith eto, ac yna mae'r cabinet yn barod i'w ddefnyddio.
Cyn-PCR: Echdynnu asid niwcleig/ychwanegu templed:
Rhaid echdynnu a thrin asid niwclëig mewn ail ardal ddynodedig, gan ddefnyddio set ar wahân o bibedi, pennau hidlo, rheseli tiwbiau, menig ffres, cotiau labordy ac offer arall. Mae'r ardal hon hefyd ar gyfer ychwanegu templed, rheolyddion a llinellau tuedd at y tiwbiau neu'r platiau cymysgedd meistr. Er mwyn osgoi halogi'r samplau asid niwclëig a echdynnwyd sy'n cael eu dadansoddi, argymhellir newid menig cyn trin rheolyddion neu safonau positif a defnyddio set ar wahân o bibedi. Ni ddylid pipedu adweithyddion PCR a chynhyrchion wedi'u hymhelaethu yn yr ardal hon. Dylid storio samplau mewn oergelloedd neu rewgelloedd dynodedig yn yr un ardal. Dylid glanhau'r man gwaith sampl yn yr un modd â'r gofod cymysgedd meistr.
Ôl-PCR: Mwyhadur a thrin y cynnyrch mwyhadur
Mae'r gofod dynodedig hwn ar gyfer prosesau ôl-helaethu a dylai fod ar wahân yn gorfforol o'r ardaloedd cyn-PCR. Fel arfer mae'n cynnwys thermocyclers a llwyfannau amser real, ac yn ddelfrydol dylai fod ganddo gabinet llif laminar ar gyfer ychwanegu cynnyrch PCR rownd 1 at adwaith rownd 2, os yw PCR nythu yn cael ei gynnal. Ni ddylid trin adweithyddion PCR ac asid niwclëig a echdynnwyd yn yr ardal hon gan fod y risg o halogiad yn uchel. Dylai'r ardal hon gynnwys set ar wahân o fenig, cotiau labordy, raciau platiau a thiwbiau, pipetau, pennau hidlo, biniau ac offer arall. Rhaid allgyrchu tiwbiau cyn eu hagor. Dylid glanhau'r gweithle sampl yn yr un modd â'r gofod cymysgu meistr.
Ôl-PCR: Dadansoddi cynnyrch
Mae'r ystafell hon ar gyfer offer canfod cynnyrch, e.e. tanciau electrofforesis gel, pecynnau pŵer, trawsoleuwr UV a'r system ddogfennu gel. Dylai'r ardal hon gynnwys setiau ar wahân o fenig, cotiau labordy, raciau platiau a thiwbiau, pipetau, pennau hidlo, biniau ac offer arall. Ni ellir dod ag unrhyw adweithyddion eraill i'r ardal hon, ac eithrio llifyn llwytho, marciwr moleciwlaidd a gel agaros, a chydrannau byffer. Dylid glanhau'r gweithle sampl yn yr un modd â'r gofod cymysgu meistr.
Nodyn pwysig
Yn ddelfrydol, ni ddylid mynd i mewn i'r ystafelloedd cyn-PCR ar yr un diwrnod os yw gwaith eisoes wedi'i wneud yn yr ystafelloedd ôl-PCR. Os na ellir osgoi hyn o gwbl, gwnewch yn siŵr bod eich dwylo'n cael eu golchi'n drylwyr yn gyntaf a bod cotiau labordy penodol yn cael eu gwisgo yn yr ystafelloedd. Ni ddylid mynd â llyfrau labordy a gwaith papur i mewn i'r ystafelloedd cyn-PCR os ydynt wedi cael eu defnyddio yn yr ystafelloedd ôl-PCR; os oes angen, cymerwch gopïau dyblyg o brotocolau/IDau sampl, ac ati.
4. Cyngor cyffredinol ar fioleg foleciwlaidd
Defnyddiwch fenig di-bowdr i osgoi ataliad yr assay. Mae techneg pipetio gywir yn hollbwysig i leihau halogiad. Gall pipetio anghywir arwain at dasgu wrth ddosbarthu hylifau a chreu aerosolau. Gellir dod o hyd i arfer da ar gyfer pipetio cywir yn y dolenni canlynol: canllaw Gilson i bibetio, fideos techneg pipetio Anachem, tiwbiau allgyrchu cyn eu hagor, a'u hagor yn ofalus i osgoi tasgu. Caewch y tiwbiau yn syth ar ôl eu defnyddio i osgoi cyflwyno halogion.
Wrth gynnal adweithiau lluosog, paratowch un cymysgedd meistr sy'n cynnwys adweithyddion cyffredin (e.e. dŵr, dNTPs, byffer, primerau ac ensym) i leihau nifer y trosglwyddiadau adweithyddion a lleihau'r bygythiad o halogiad. Argymhellir gosod y cymysgedd meistr ar rew neu floc oer. Gall defnyddio ensym Dechrau Poeth helpu i leihau cynhyrchiad cynhyrchion amhenodol. Amddiffynwch adweithyddion sy'n cynnwys chwiliedyddion fflwroleuol rhag golau er mwyn osgoi diraddio.
5. Rheolaethau mewnol
Cynhwyswch reolaethau positif a negatif sydd wedi'u nodweddu'n dda ac wedi'u cadarnhau, ynghyd â rheolaeth heb dempled ym mhob adwaith, a llinell duedd titrad aml-bwynt ar gyfer adweithiau meintiol. Ni ddylai'r rheolaeth bositif fod mor gryf fel ei bod yn peri risg halogiad. Cynhwyswch reolaethau echdynnu positif a negatif wrth echdynnu asid niwclëig.
Argymhellir bod cyfarwyddiadau clir yn cael eu postio ym mhob un o'r ardaloedd fel bod defnyddwyr yn ymwybodol o reolau ymddygiad. Efallai y bydd labordai diagnostig sy'n canfod lefelau isel iawn o DNA neu RNA mewn samplau clinigol eisiau mabwysiadu'r mesur diogelwch ychwanegol o gael systemau trin aer ar wahân gyda phwysau aer ychydig yn bositif yn yr ystafelloedd cyn-PCR a phwysau aer ychydig yn negyddol yn yr ystafelloedd ôl-PCR.
Yn olaf, mae datblygu cynllun sicrhau ansawdd (SA) yn ddefnyddiol. Dylai cynllun o'r fath gynnwys rhestrau o stociau meistr adweithyddion a stociau gweithio, rheolau ar gyfer storio citiau ac adweithyddion, adrodd ar ganlyniadau rheoli, rhaglenni hyfforddi staff, algorithmau datrys problemau, a chamau adferol pan fo angen.
6. Llyfryddiaeth
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Pennod 3: Sefydlu labordy qPCR. Dogfen ganllaw ar gyfer profi dyfroedd hamdden gan ddefnyddio dull qPCR USEPA 1611. Prifysgol Talaith Lansing-Michigan.
Iechyd Cyhoeddus Lloegr, GIG. Safonau'r DU ar gyfer ymchwiliadau microbioleg: Arfer Labordy Da wrth gynnal asesiadau ymhelaethu moleciwlaidd). Canllawiau Ansawdd. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Sefydlu labordy PCR. Cold Spring Harb Protocol. 2007;7.
Schroeder S 2013. Cynnal a chadw arferol allgyrchyddion: glanhau, cynnal a chadw a diheintio allgyrchyddion, rotorau ac addaswyr (Papur Gwyn Rhif 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Arfer Labordy Clinigol Da (GCLP) ar gyfer profion moleciwlaidd a ddefnyddir mewn labordai diagnostig, Yn: Akyar I, golygydd. Sbectrwm eang o reoli ansawdd. Rijeka, Croatia: Intech; 2011: 29–52.
Amser postio: Gorff-16-2020
