Molekularne metode detekcije imaju sposobnost proizvodnje velike količine nukleinske kiseline putem amplifikacije tragova pronađenih u uzorcima. Iako je ovo korisno za omogućavanje osjetljive detekcije, također uvodi mogućnost kontaminacije širenjem aerosola amplifikacije u laboratorijskom okruženju. Prilikom provođenja eksperimenata, mogu se poduzeti mjere kako bi se izbjegla kontaminacija reagensa, laboratorijske opreme i radnog prostora, jer takva kontaminacija može generirati lažno pozitivne (ili lažno negativne) rezultate.
Kako bi se smanjila vjerovatnoća kontaminacije, Dobra laboratorijska praksa treba se primjenjivati u svakom trenutku. Konkretno, treba poduzeti mjere opreza u vezi sa sljedećim tačkama:
1. Rukovanje reagensima
2. Organizacija radnog prostora i opreme
3. Savjeti za upotrebu i čišćenje određenog molekularnog prostora
4. Opći savjeti iz molekularne biologije
5. Interne kontrole
6. Bibliografija
1. Rukovanje reagensima
Prije otvaranja kratko centrifugirajte epruvete s reagensima kako biste izbjegli stvaranje aerosola. Podijelite reagense na alikvote kako biste izbjegli višestruko zamrzavanje i odmrzavanje i kontaminaciju glavnih zaliha. Jasno označite i datirajte sve epruvete s reagensima i reakcijama te vodite evidenciju o brojevima serija i šarži reagensa korištenih u svim eksperimentima. Pipetirajte sve reagense i uzorke koristeći filter vrhove. Prije kupovine, preporučljivo je potvrditi s proizvođačem da li filter vrhovi odgovaraju marki pipete koja će se koristiti.
2. Organizacija radnog prostora i opreme
Radni prostor treba biti organiziran tako da se osigura da se tok rada odvija u jednom smjeru, od čistih područja (prije PCR-a) do prljavih područja (nakon PCR-a). Sljedeće opće mjere opreza pomoći će u smanjenju mogućnosti kontaminacije. Imati odvojene određene prostorije, ili barem fizički odvojene prostore, za: pripremu mastermiksa, ekstrakciju nukleinskih kiselina i dodavanje DNK kalupa, amplifikaciju i rukovanje amplificiranim produktom i analizu produkta, npr. gel elektroforeza.
U nekim okruženjima, teško je imati 4 odvojene prostorije. Moguća, ali manje poželjna opcija je priprema mastermiksa u određenom prostoru, npr. u laminarnom kabinetu. U slučaju ugniježđene PCR amplifikacije, priprema mastermiksa za drugi krug reakcije treba se obaviti u 'čistom' prostoru za pripremu mastermiksa, ali inokulacija primarnim PCR produktom treba se obaviti u prostoriji za amplifikaciju, a ako je moguće, u namjenskom prostoru (npr. u laminarnom kabinetu).
Svaka prostorija/prostor zahtijeva zaseban set jasno označenih pipeta, filterskih nastavaka, nosača epruveta, vorteks miješalica, centrifuga (ako je relevantno), olovaka, generičkih laboratorijskih reagensa, laboratorijskih mantila i kutija s rukavicama koje će ostati na odgovarajućim radnim mjestima. Ruke se moraju oprati, a rukavice i laboratorijski mantili mijenjati prilikom kretanja između određenih područja. Reagensi i oprema ne smiju se premještati iz prljavog u čisto područje. Ukoliko dođe do ekstremnog slučaja kada se reagens ili dio opreme mora premjestiti unazad, prvo se mora dekontaminirati s 10% natrijum hipohloritom, a zatim obrisati sterilnom vodom.
Napomena
Rastvor natrijum hipohlorita od 10% mora se pripremati svjež svakodnevno. Kada se koristi za dekontaminaciju, treba se pridržavati minimalnog vremena kontakta od 10 minuta.
Alternativno, mogu se koristiti komercijalno dostupni proizvodi koji su validirani kao površinska dekontaminanta koja uništavaju DNK ako lokalne sigurnosne preporuke ne dozvoljavaju upotrebu natrijum hipohlorita ili ako natrijum hipohlorit nije pogodan za dekontaminaciju metalnih dijelova opreme.
Idealno bi bilo da se osoblje pridržava etosa jednosmjernog radnog toka i da se ne vraća iz prljavih prostora (nakon PCR-a) nazad u čiste prostore (prije PCR-a) istog dana. Međutim, mogu postojati slučajevi kada je to neizbježno. Kada se takva prilika ukaže, osoblje mora voditi računa da temeljito opere ruke, promijeni rukavice, koristi za to predviđeni laboratorijski mantil i ne unosi nikakvu opremu koju će htjeti ponovo iznijeti iz prostorije, poput laboratorijskih knjiga. Takve kontrolne mjere treba naglasiti tokom obuke osoblja o molekularnim metodama.
Nakon upotrebe, radne površine treba očistiti 10%-tnim natrijum hipohloritom (nakon čega slijedi sterilna voda za uklanjanje ostataka izbjeljivača), 70%-tnim etanolom ili validiranim komercijalno dostupnim dekontaminantom koji uništava DNK. Idealno bi bilo da se postave ultraljubičaste (UV) lampe kako bi se omogućila dekontaminacija zračenjem. Međutim, upotreba UV lampi treba biti ograničena na zatvorene radne prostore, npr. sigurnosne ormare, kako bi se ograničila izloženost laboratorijskog osoblja UV zračenju. Molimo vas da se pridržavate uputa proizvođača za njegu, ventilaciju i čišćenje UV lampi kako biste osigurali da lampe ostanu učinkovite.
Ako se koristi 70% etanol umjesto natrijum hipohlorita, za potpunu dekontaminaciju bit će potrebno zračenje UV svjetlom.
Ne čistite vortex i centrifugu natrijum hipohloritom; umjesto toga, obrišite sa 70% etanolom i izložite UV svjetlu ili koristite komercijalno sredstvo za dekontaminaciju DNK. U slučaju prolijevanja, obratite se proizvođaču za daljnje savjete o čišćenju. Ako upute proizvođača to dozvoljavaju, pipete treba rutinski sterilizirati u autoklavu. Ako se pipete ne mogu autoklavirati, dovoljno ih je očistiti sa 10% natrijum hipohloritom (nakon čega slijedi temeljito brisanje sterilnom vodom) ili komercijalnim sredstvom za dekontaminaciju DNK, a zatim izlaganje UV zračenju.
Čišćenje visokoprocentnim natrijum hipohloritom može na kraju oštetiti plastiku i metal pipeta ako se vrši redovno; prvo provjerite preporuke proizvođača. Svu opremu treba redovno kalibrirati prema rasporedu koji preporučuje proizvođač. Određena osoba treba biti zadužena za osiguravanje pridržavanja rasporeda kalibracije, vođenje detaljnih dnevnika i jasno prikazivanje servisnih naljepnica na opremi.
3. Savjeti za upotrebu i čišćenje određenog molekularnog prostora
Prije PCR-a: Alikvotiranje reagensa / priprema mastermiksa: Ovo bi trebao biti najčišći od svih prostora koji se koriste za pripremu molekularnih eksperimenata i idealno bi trebao biti određeni laminarni kabinet opremljen UV svjetlom. Uzorci, ekstrahirane nukleinske kiseline i amplificirani PCR produkti ne smiju se rukovati u ovom prostoru. Amplifikacijski reagensi trebaju se čuvati u zamrzivaču (ili hladnjaku, prema preporukama proizvođača) u istom određenom prostoru, idealno pored laminarnog kabineta ili pred-PCR prostora. Rukavice treba mijenjati svaki put pri ulasku u pred-PCR prostor ili laminarni kabinet.
Pred-PCR područje ili laminarni kabinet treba očistiti prije i poslije upotrebe na sljedeći način: Obrišite sve predmete u kabinetu, npr. pipete, kutije za vrhove, vortex, centrifugu, nosače epruveta, olovke itd. sa 70% etanolom ili komercijalnim dekontaminantom koji uništava DNK i ostavite da se osuši. U slučaju zatvorenog radnog prostora, npr. laminarnog kabineta, izložite poklopac UV svjetlu 30 minuta.
Napomena
Ne izlažite reagense UV svjetlu; premjestite ih u kabinet tek kada je čist. Ako se izvodi PCR s reverznom transkripcijom, može biti korisno obrisati površine i opremu otopinom koja razgrađuje RNaze pri kontaktu. Ovo može pomoći u izbjegavanju lažno negativnih rezultata uzrokovanih enzimskom razgradnjom RNK. Nakon dekontaminacije i prije pripreme mastermiksa, rukavice treba još jednom promijeniti, a zatim je kabinet spreman za upotrebu.
Pre-PCR: Ekstrakcija nukleinskih kiselina/dodavanje kalupa:
Nukleinska kiselina mora se ekstrahirati i rukovati njome u drugom određenom prostoru, koristeći zaseban set pipeta, filter vrhova, stalke za epruvete, nove rukavice, laboratorijske mantile i drugu opremu. Ovo područje je također namijenjeno dodavanju predložaka, kontrola i linija trenda u epruvete ili ploče s mastermixom. Kako bi se izbjegla kontaminacija ekstrahiranih uzoraka nukleinskih kiselina koji se analiziraju, preporučuje se promjena rukavica prije rukovanja pozitivnim kontrolama ili standardima i korištenje zasebnog seta pipeta. PCR reagensi i amplificirani produkti ne smiju se pipetirati u ovom prostoru. Uzorke treba čuvati u određenim hladnjacima ili zamrzivačima u istom prostoru. Radni prostor za uzorke treba čistiti na isti način kao i prostor s mastermixom.
Post-PCR: Amplifikacija i rukovanje amplificiranim produktom
Ovaj određeni prostor je namijenjen za procese nakon amplifikacije i trebao bi biti fizički odvojen od područja prije PCR-a. Obično sadrži termociklere i platforme u realnom vremenu, a idealno bi bilo da ima kabinet s laminarnim protokom za dodavanje PCR produkta iz prve runde u reakciju druge runde, ako se izvodi ugniježđena PCR. PCR reagensi i ekstrahirana nukleinska kiselina ne smiju se rukovati u ovom području jer je rizik od kontaminacije visok. Ovo područje treba imati zaseban set rukavica, laboratorijskih mantila, nosača ploča i epruveta, pipeta, filterskih vrhova, kanti i druge opreme. Epruvete se moraju centrifugirati prije otvaranja. Radni prostor za uzorke treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermix.
Post-PCR: Analiza proizvoda
Ova prostorija je namijenjena za opremu za detekciju proizvoda, npr. rezervoare za gel elektroforezu, baterijske sklopove, UV transiluminator i sistem za dokumentaciju gelova. Ovaj prostor treba imati odvojene setove rukavica, laboratorijske mantile, stalke za ploče i epruvete, pipete, filtere, kante i drugu opremu. U ovaj prostor se ne smiju unositi drugi reagensi, osim boje za punjenje, molekularnog markera i agaroznog gela, te komponenti pufera. Radni prostor za uzorke treba čistiti na isti način kao i prostor za mastermix.
Važna napomena
Idealno bi bilo da se u prostorije za prijevremenu PCR analizu ne ulaze istog dana ako je rad već obavljen u prostorijama za prijevremenu PCR analizu. Ako je to potpuno neizbježno, prvo se temeljito operu ruke i nose posebni laboratorijski mantili. Laboratorijske knjige i dokumentacija ne smiju se unositi u prostorije za prijevremenu PCR analizu ako su korišteni u prostorijama za prijevremenu PCR analizu; ako je potrebno, napravite duplikate ispisa protokola/identifikacijskih brojeva uzoraka itd.
4. Opći savjeti iz molekularne biologije
Koristite rukavice bez pudera kako biste izbjegli inhibiciju testa. Ispravna tehnika pipetiranja je od ključne važnosti za smanjenje kontaminacije. Nepravilno pipetiranje može dovesti do prskanja prilikom doziranja tekućina i stvaranja aerosola. Dobra praksa za pravilno pipetiranje može se pronaći na sljedećim linkovima: Gilsonov vodič za pipetiranje, Anachemovi videozapisi o tehnici pipetiranja, Centrifugirajte epruvete prije otvaranja i pažljivo ih otvorite kako biste izbjegli prskanje. Zatvorite epruvete odmah nakon upotrebe kako biste izbjegli unošenje kontaminanata.
Prilikom izvođenja više reakcija, pripremite jednu mastermix smjesu koja sadrži uobičajene reagense (npr. vodu, dNTP-ove, pufer, prajmere i enzim) kako biste smanjili broj prijenosa reagensa i smanjili opasnost od kontaminacije. Preporučuje se da se mastermix postavi na led ili hladni blok. Upotreba enzima za vrući start može pomoći u smanjenju proizvodnje nespecifičnih proizvoda. Zaštitite reagense koji sadrže fluorescentne probe od svjetlosti kako biste izbjegli njihovu degradaciju.
5. Interne kontrole
Uključite dobro okarakterizirane, potvrđene pozitivne i negativne kontrole, zajedno s kontrolom bez predloška u svim reakcijama i višetočkovnom titriranom linijom trenda za kvantitativne reakcije. Pozitivna kontrola ne smije biti toliko jaka da predstavlja rizik od kontaminacije. Uključite pozitivne i negativne kontrole ekstrakcije kada izvodite ekstrakciju nukleinske kiseline.
Preporučuje se da se u svakom od područja postave jasna uputstva kako bi korisnici bili svjesni pravila ponašanja. Dijagnostički laboratoriji koji detektuju vrlo niske nivoe DNK ili RNK u kliničkim uzorcima mogu usvojiti dodatne sigurnosne mjere u vidu odvojenih sistema za obradu zraka sa blago pozitivnim pritiskom zraka u prostorijama prije PCR-a i blago negativnim pritiskom zraka u prostorijama nakon PCR-a.
Konačno, razvoj plana osiguranja kvaliteta (QA) je koristan. Takav plan treba da uključuje liste glavnih i radnih zaliha reagensa, pravila za skladištenje kompleta i reagensa, izvještavanje o rezultatima kontrole, programe obuke osoblja, algoritme za rješavanje problema i korektivne mjere kada je to potrebno.
6. Bibliografija
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Poglavlje 3: Osnivanje qPCR laboratorije. Smjernice za testiranje rekreacijskih voda korištenjem USEPA qPCR metode 1611. Lansing - Državni univerzitet Michigan.
Javno zdravstvo Engleske, NHS. Standardi Ujedinjenog Kraljevstva za mikrobiološka istraživanja: Dobra laboratorijska praksa pri izvođenju testova molekularne amplifikacije. Smjernice za kvalitet. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Osnivanje PCR laboratorije. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutinsko održavanje centrifuga: čišćenje, održavanje i dezinfekcija centrifuga, rotora i adaptera (Bijela knjiga br. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Dobra klinička laboratorijska praksa (GCLP) za molekularno zasnovane testove koji se koriste u dijagnostičkim laboratorijama, U: Akyar I, urednik. Široki spektar kontrole kvalitete. Rijeka, Hrvatska: Intech; 2011: 29–52.
Vrijeme objave: 16. jul 2020.
