Методите за молекулярно откриване имат способността да произвеждат голям обем нуклеинова киселина чрез амплификация на следи от вещества, открити в пробите. Макар че това е полезно за осигуряване на чувствително откриване, то също така въвежда възможност за замърсяване чрез разпространението на амплификационни аерозоли в лабораторната среда. При провеждане на експерименти могат да се предприемат мерки за избягване на замърсяване на реактивите, лабораторното оборудване и работното пространство, тъй като такова замърсяване може да доведе до фалшиво положителни (или фалшиво отрицателни) резултати.
За да се намали вероятността от замърсяване, винаги трябва да се прилага Добрата лабораторна практика. По-специално, трябва да се вземат предпазни мерки по отношение на следните точки:
1. Работа с реактиви
2. Организация на работното пространство и оборудването
3. Съвети за употреба и почистване на определеното молекулярно пространство
4. Общи съвети по молекулярна биология
5. Вътрешен контрол
6. Библиография
1. Работа с реактиви
Центрофугирайте за кратко епруветките с реактиви преди отваряне, за да избегнете образуването на аерозоли. Разпределете реактивите на аликвотни части, за да избегнете многократно замразяване и размразяване и замърсяване на мастер-стоковете. Ясно етикетирайте и датирайте всички епруветки с реактиви и реакции и поддържайте дневници на партидите и номерата на реактивите, използвани във всички експерименти. Пипетирайте всички реактиви и проби, като използвате филтърни накрайници. Преди покупка е препоръчително да се уверите с производителя, че филтърните накрайници са подходящи за марката пипета, която ще се използва.
2. Организация на работното пространство и оборудването
Работното пространство трябва да бъде организирано така, че да се гарантира, че потокът от работа се осъществява в една посока - от чисти зони (преди PCR) към замърсени зони (след PCR). Следните общи предпазни мерки ще помогнат за намаляване на вероятността от замърсяване. Осигурете отделни обособени помещения или поне физически отделни зони за: приготвяне на мастермикс, екстракция на нуклеинови киселини и добавяне на ДНК матрица, амплификация и работа с амплифициран продукт и анализ на продукта, напр. гел електрофореза.
В някои условия е трудно да се разполага с 4 отделни помещения. Възможен, но по-малко желателен вариант е приготвянето на мастермикса да се извърши в зона за съхранение, например в ламинарен шкаф. В случай на вложена PCR амплификация, приготвянето на мастермикса за втория кръг на реакцията трябва да се извърши в „чистата“ зона за приготвяне на мастермикса, но инокулацията с първичния PCR продукт трябва да се извърши в стаята за амплификация и, ако е възможно, в специално обособена зона за съхранение (например в ламинарен шкаф).
Всяка стая/зона се нуждае от отделен комплект ясно обозначени пипети, филтърни накрайници, стойки за епруветки, вортекс миксери, центрофуги (ако е приложимо), химикалки, лабораторни реактиви с общо предназначение, лабораторни престилки и кутии с ръкавици, които ще останат на съответните им работни места. Ръцете трябва да се измиват, а ръкавиците и лабораторните престилки да се сменят при придвижване между определените зони. Реактивите и оборудването не трябва да се местят от замърсена зона в чиста зона. В случай на краен случай, при който реактив или оборудване трябва да се преместят назад, първо трябва да се деконтаминират с 10% натриев хипохлорит, последвано от избърсване със стерилна вода.
Забележка
10%-ният разтвор на натриев хипохлорит трябва да се приготвя пресен ежедневно. Когато се използва за обеззаразяване, трябва да се спазва минималното време за контакт от 10 минути.
Като алтернатива, могат да се използват търговски достъпни продукти, валидирани като повърхностни деконтаминанти, разрушаващи ДНК, ако местните препоръки за безопасност не позволяват използването на натриев хипохлорит или ако натриевият хипохлорит не е подходящ за обеззаразяване на металните части на оборудването.
В идеалния случай персоналът трябва да спазва етиката на еднопосочния работен поток и да не се връща от мръсни зони (след PCR) обратно в чисти зони (преди PCR) в същия ден. Възможно е обаче да има случаи, когато това е неизбежно. Когато възникне такъв случай, персоналът трябва да се погрижи да си измие старателно ръцете, да смени ръкавиците, да използва определената лабораторна престилка и да не внася никакво оборудване, което ще иска да изнесе отново от стаята, като например лабораторни книги. Такива контролни мерки трябва да бъдат подчертани при обучението на персонала по молекулярни методи.
След употреба, работните пространства трябва да се почистват с 10% натриев хипохлорит (последвано от стерилна вода за отстраняване на остатъчната белина), 70% етанол или валидиран търговски достъпен деконтаминант, разрушаващ ДНК. В идеалния случай трябва да се монтират ултравиолетови (UV) лампи, за да се осигури деконтаминация чрез облъчване. Използването на UV лампи обаче трябва да се ограничи до затворени работни зони, например предпазни шкафове, за да се ограничи излагането на лабораторния персонал на UV лъчение. Моля, спазвайте инструкциите на производителя за грижа, вентилация и почистване на UV лампите, за да се гарантира, че лампите остават ефективни.
Ако използвате 70% етанол вместо натриев хипохлорит, ще е необходимо облъчване с UV светлина, за да завършите деконтаминацията.
Не почиствайте вортекс и центрофугата с натриев хипохлорит; вместо това, избършете със 70% етанол и изложете на UV светлина или използвайте търговски деконтаминант, разрушаващ ДНК. При разливи, проверете с производителя за допълнителни съвети за почистване. Ако инструкциите на производителя го позволяват, пипетите трябва рутинно да се стерилизират в автоклав. Ако пипетите не могат да се автоклавират, е достатъчно да се почистят с 10% натриев хипохлорит (последвано от щателно избърсване със стерилна вода) или с търговски деконтаминант, разрушаващ ДНК, последвано от UV излагане.
Почистването с високопроцентен натриев хипохлорит може евентуално да повреди пластмасите и металите на пипетите, ако се извършва редовно; първо проверете препоръките на производителя. Цялото оборудване трябва да се калибрира редовно съгласно препоръчания от производителя график. Определено лице трябва да отговаря за спазването на графика за калибриране, воденето на подробни дневници и ясното поставяне на сервизните етикети на оборудването.
3. Съвети за употреба и почистване на определеното молекулярно пространство
Предварителна PCR: Аликвотиране на реагенти / подготовка на мастермикс: Това трябва да е най-чистото от всички пространства, използвани за подготовка на молекулярни експерименти, и в идеалния случай трябва да е обозначен ламинарен шкаф, оборудван с UV светлина. Проби, екстрахирана нуклеинова киселина и амплифицирани PCR продукти не трябва да се обработват в тази зона. Амплификационните реагенти трябва да се съхраняват във фризер (или хладилник, съгласно препоръките на производителя) в същото обозначено пространство, в идеалния случай до ламинарен шкаф или зоната преди PCR. Ръкавиците трябва да се сменят всеки път при влизане в зоната преди PCR или ламинарен шкаф.
Зоната преди PCR или ламинарен шкаф трябва да се почистят преди и след употреба, както следва: Избършете всички предмети в шкафа, напр. пипети, кутии за накрайници, вортекс, центрофуга, стойки за епруветки, сондажи и др. със 70% етанол или търговски деконтаминант, разрушаващ ДНК, и оставете да изсъхнат. В случай на затворена работна зона, напр. ламинарен шкаф, изложете капака на UV светлина за 30 минути.
Забележка
Не излагайте реагентите на UV светлина; преместете ги в шкафа само след като е чист. Ако извършвате PCR с обратна транскрипция, може да е полезно да избършете повърхностите и оборудването с разтвор, който разгражда РНКазите при контакт. Това може да помогне за избягване на фалшиво отрицателни резултати от ензимното разграждане на РНК. След деконтаминация и преди приготвяне на мастермикса, ръкавиците трябва да се сменят още веднъж и след това шкафът е готов за употреба.
Предварителна PCR: Екстракция на нуклеинова киселина/добавяне на шаблон:
Нуклеиновата киселина трябва да се екстрахира и обработва във втора определена зона, като се използва отделен комплект пипети, филтърни накрайници, стойки за епруветки, нови ръкавици, лабораторни престилки и друго оборудване. Тази зона е предназначена и за добавяне на шаблон, контроли и линии на тренда към епруветките или плаките с мастермикс. За да се избегне замърсяване на екстрахираните проби от нуклеинови киселини, които се анализират, се препоръчва да се сменят ръкавиците преди работа с положителни контроли или стандарти и да се използва отделен комплект пипети. PCR реагенти и амплифицирани продукти не трябва да се пипетират в тази зона. Пробите трябва да се съхраняват в определени хладилници или фризери в същата зона. Работното пространство за пробите трябва да се почиства по същия начин като пространството с мастермикса.
След PCR: Амплификация и обработка на амплифицирания продукт
Това определено пространство е предназначено за пост-амплификационни процеси и трябва да бъде физически отделено от зоните преди PCR. Обикновено съдържа термоциклери и платформи в реално време и в идеалния случай трябва да има ламинарен шкаф за добавяне на PCR продукта от кръг 1 към реакцията от кръг 2, ако се извършва вложена PCR. PCR реагенти и екстрахирана нуклеинова киселина не трябва да се борави в тази зона, тъй като рискът от замърсяване е висок. Тази зона трябва да има отделен комплект ръкавици, лабораторни престилки, стойки за плаки и епруветки, пипети, филтърни накрайници, контейнери и друго оборудване. Епруветките трябва да се центрофугират преди отваряне. Работното пространство за пробите трябва да се почиства по същия начин като пространството за мастермикс.
След PCR: Анализ на продукта
Тази стая е предназначена за оборудване за откриване на продукти, например резервоари за гел електрофореза, захранващи блокове, UV трансилюминатор и система за документиране на гела. В тази зона трябва да има отделни комплекти ръкавици, лабораторни престилки, стойки за плаки и епруветки, пипети, филтърни накрайници, контейнери и друго оборудване. В тази зона не могат да се внасят други реактиви, с изключение на багрилото за зареждане, молекулярния маркер и агарозния гел, както и буферните компоненти. Работното пространство за пробите трябва да се почиства по същия начин като пространството за мастермикс.
Важна забележка
В идеалния случай, в стаите преди PCR не трябва да се влиза в същия ден, ако вече е била извършена работа в стаите след PCR. Ако това е напълно неизбежно, уверете се, че ръцете са предварително измити и че в стаите се носят специални лабораторни престилки. Лабораторните книги и документи не трябва да се внасят в стаите преди PCR, ако са били използвани в стаите след PCR; ако е необходимо, вземете дубликати на разпечатки на протоколи/идентификационни номера на проби и др.
4. Общи съвети по молекулярна биология
Използвайте ръкавици без пудра, за да избегнете инхибиране на анализа. Правилната техника на пипетиране е от първостепенно значение за намаляване на замърсяването. Неправилното пипетиране може да доведе до пръски при дозиране на течности и образуване на аерозоли. Добри практики за правилно пипетиране можете да намерите на следните връзки: Ръководство за пипетиране на Gilson, Видеоклипове за техника на пипетиране на Anachem, Центрофугирайте епруветките преди отваряне и ги отваряйте внимателно, за да избегнете пръски. Затваряйте епруветките веднага след употреба, за да избегнете навлизането на замърсители.
Когато извършвате множество реакции, пригответе един мастермикс, съдържащ обичайни реагенти (напр. вода, dNTP, буфер, праймери и ензим), за да се сведе до минимум броят на трансферите на реагенти и да се намали рискът от замърсяване. Препоръчително е мастермиксът да се постави върху лед или студен блок. Използването на ензим Hot Start може да помогне за намаляване на производството на неспецифични продукти. Защитете реагентите, съдържащи флуоресцентни сонди, от светлина, за да избегнете разграждане.
5. Вътрешен контрол
Включете добре характеризирани, потвърдени положителни и отрицателни контроли, заедно с контрола без шаблон във всички реакции и многоточкова титрувана линия на тренда за количествени реакции. Положителната контрола не трябва да е толкова силна, че да представлява риск от замърсяване. Включете положителни и отрицателни контроли за екстракция, когато извършвате екстракция на нуклеинова киселина.
Препоръчително е да се поставят ясни инструкции във всяка от зоните, така че потребителите да са запознати с правилата за поведение. Диагностичните лаборатории, които откриват много ниски нива на ДНК или РНК в клинични проби, може да поискат да предприемат допълнителна мярка за сигурност, като имат отделни системи за обработка на въздуха с леко положително въздушно налягане в помещенията преди PCR и леко отрицателно въздушно налягане в помещенията след PCR.
Накрая, разработването на план за осигуряване на качеството (ОК) е полезно. Такъв план трябва да включва списъци с основни и работни запаси от реактиви, правила за съхранение на комплекти и реактиви, докладване на резултатите от контрола, програми за обучение на персонала, алгоритми за отстраняване на неизправности и коригиращи действия, когато е необходимо.
6. Библиография
Аслан А, Кинзелман Дж., Дрийлин Е., Ананьева Т., Лавандър Дж. Глава 3: Създаване на qPCR лаборатория. Ръководен документ за тестване на води за отдих, използващ метода qPCR на USEPA 1611. Лансинг - Мичигански държавен университет.
Public Health England, NHS. Стандарти на Обединеното кралство за микробиологични изследвания: Добра лабораторна практика при извършване на анализи за молекулярна амплификация. Ръководство за качество. 2013;4(4):1–15.
Мифлин Т. Създаване на PCR лаборатория. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шрьодер С. 2013. Рутинна поддръжка на центрофуги: почистване, поддръжка и дезинфекция на центрофуги, ротори и адаптери (Бяла книга № 14). Хамбург: Епендорф; 2013.
Виана Р.В., Уолис К.Л. Добра клинична лабораторна практика (GCLP) за молекулярно-базирани тестове, използвани в диагностичните лаборатории, В: Акяр И., редактор. Широк спектър на контрол на качеството. Риека, Хърватия: Intech; 2011: 29–52.
Време на публикуване: 16 юли 2020 г.
