Moleküler tespit yöntemleri, numunelerde bulunan eser miktardaki nükleik asitlerin amplifikasyonu yoluyla büyük hacimlerde nükleik asit üretme yeteneğine sahiptir. Bu, hassas tespite olanak sağlamasının yanı sıra, laboratuvar ortamında amplifikasyon aerosollerinin yayılması yoluyla kontaminasyon olasılığını da beraberinde getirir. Deneyler yapılırken, reaktiflerin, laboratuvar ekipmanlarının ve tezgah alanının kontaminasyonunu önlemek için önlemler alınabilir; çünkü bu kontaminasyon yanlış pozitif (veya yanlış negatif) sonuçlara yol açabilir.
Kontaminasyon olasılığını azaltmak için, her zaman İyi Laboratuvar Uygulamaları uygulanmalıdır. Özellikle aşağıdaki noktalara ilişkin önlemler alınmalıdır:
1. Reaktiflerin kullanımı
2. Çalışma alanı ve ekipmanların organizasyonu
3. Belirlenen moleküler alan için kullanım ve temizlik tavsiyeleri
4. Genel moleküler biyoloji tavsiyeleri
5. İç kontroller
6. Kaynakça
1. Reaktiflerin kullanımı
Aerosol oluşumunu önlemek için reaktif tüplerini açmadan önce kısa bir süre santrifüjleyin. Tekrarlanan donma-çözülme işlemlerini ve ana stokların kirlenmesini önlemek için reaktifleri alikotlayın. Tüm reaktif ve reaksiyon tüplerini açıkça etiketleyip tarih atın ve tüm deneylerde kullanılan reaktif lot ve parti numaralarının kayıtlarını tutun. Tüm reaktifleri ve numuneleri filtreli uçlar kullanarak pipetleyin. Satın almadan önce, filtreli uçların kullanılacak pipet markasına uygun olup olmadığını üreticiden teyit etmeniz önerilir.
2. Çalışma alanı ve ekipmanların organizasyonu
Çalışma alanı, iş akışının tek yönde, temiz alanlardan (PCR öncesi) kirli alanlara (PCR sonrası) doğru gerçekleşmesini sağlayacak şekilde düzenlenmelidir. Aşağıdaki genel önlemler, kontaminasyon olasılığını azaltmaya yardımcı olacaktır. Mastermix hazırlama, nükleik asit ekstraksiyonu ve DNA şablonu ekleme, amplifikasyon ve amplifiye ürünün işlenmesi ve ürün analizi (örneğin jel elektroforezi) için ayrı odalar veya en azından fiziksel olarak ayrı alanlar oluşturun.
Bazı ortamlarda 4 ayrı oda bulunması zordur. Mümkün ancak daha az tercih edilen bir seçenek, ana karışımın hazırlanmasını bir muhafaza alanında, örneğin laminar akışlı bir kabinde yapmaktır. İç içe PCR amplifikasyonu durumunda, ikinci tur reaksiyon için ana karışımın hazırlanması, ana karışımın hazırlanması için kullanılan 'temiz' alanda yapılmalıdır; ancak birincil PCR ürünüyle aşılama, amplifikasyon odasında ve mümkünse özel bir muhafaza alanında (örneğin laminar akışlı bir kabin) yapılmalıdır.
Her oda/alan için, ilgili çalışma istasyonlarında kalacak şekilde ayrı bir set halinde, açıkça etiketlenmiş pipetler, filtre uçları, tüp rafları, vorteksler, santrifüjler (varsa), kalemler, genel laboratuvar reaktifleri, laboratuvar önlükleri ve eldiven kutuları bulunmalıdır. Belirlenen alanlar arasında geçiş yaparken eller yıkanmalı, eldivenler ve laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir. Reaktifler ve ekipmanlar kirli bir alandan temiz bir alana taşınmamalıdır. Bir reaktifin veya ekipmanın geriye doğru taşınması gereken aşırı bir durum ortaya çıkarsa, önce %10 sodyum hipoklorit ile dekontamine edilmeli ve ardından steril suyla silinmelidir.
Not
%10'luk sodyum hipoklorit solüsyonu her gün taze olarak hazırlanmalıdır. Dekontaminasyon amacıyla kullanıldığında, minimum 10 dakikalık temas süresine uyulmalıdır.
Alternatif olarak, yerel güvenlik önerileri sodyum hipoklorit kullanımına izin vermiyorsa veya sodyum hipoklorit ekipmanın metalik parçalarının dekontamine edilmesi için uygun değilse, DNA'yı yok eden yüzey dekontaminantları olarak onaylanmış ticari olarak satılan ürünler kullanılabilir.
İdeal olarak, personel tek yönlü iş akışı ilkesine uymalı ve aynı gün kirli alanlardan (PCR sonrası) temiz alanlara (PCR öncesi) geri dönmemelidir. Ancak, bunun kaçınılmaz olduğu durumlar olabilir. Böyle bir durum ortaya çıktığında, personel ellerini iyice yıkamalı, eldiven değiştirmeli, belirlenen laboratuvar önlüğünü kullanmalı ve laboratuvar kitapları gibi odadan tekrar çıkarmak isteyecekleri hiçbir ekipmanı odaya sokmamalıdır. Bu tür kontrol önlemleri, personele moleküler yöntemler konusunda verilen eğitimde vurgulanmalıdır.
Kullanımdan sonra, tezgah alanları %10 sodyum hipoklorit (ardından kalan çamaşır suyunu çıkarmak için steril su), %70 etanol veya piyasada bulunan onaylı bir DNA yok edici dekontaminasyon maddesi ile temizlenmelidir. İdeal olarak, ışınlama yoluyla dekontaminasyonu mümkün kılmak için ultraviyole (UV) lambalar takılmalıdır. Ancak, laboratuvar personelinin UV maruziyetini sınırlamak için UV lambalarının kullanımı kapalı çalışma alanlarıyla (örneğin güvenlik dolapları) sınırlandırılmalıdır. Lambaların etkinliğini korumak için lütfen UV lambası bakımı, havalandırması ve temizliği konusunda üretici talimatlarına uyun.
Sodyum hipoklorit yerine %70 etanol kullanılması durumunda dekontaminasyonun tamamlanması için UV ışığı ile ışınlama yapılması gerekecektir.
Vorteks ve santrifüjü sodyum hipoklorit ile temizlemeyin; bunun yerine %70 etanol ile silin ve UV ışığına maruz bırakın veya piyasada bulunan bir DNA yok edici dekontaminant kullanın. Dökülmeler için, daha fazla temizlik tavsiyesi için üreticiye danışın. Üretici talimatları uygunsa, pipetler rutin olarak otoklavda sterilize edilmelidir. Pipetler otoklavlanamıyorsa, %10 sodyum hipoklorit ile temizlenmeleri (ardından steril suyla iyice silinmeleri) veya piyasada bulunan bir DNA yok edici dekontaminant ile temizlendikten sonra UV ışığına maruz bırakılmaları yeterli olacaktır.
Yüksek oranda sodyum hipoklorit ile temizlik, düzenli olarak yapılırsa pipet plastiklerine ve metallerine zarar verebilir; önce üreticinin önerilerini kontrol edin. Tüm ekipmanların, üreticinin önerdiği programa göre düzenli olarak kalibre edilmesi gerekir. Kalibrasyon programına uyulmasını, ayrıntılı kayıtların tutulmasını ve servis etiketlerinin ekipman üzerinde açıkça gösterilmesini sağlamaktan sorumlu bir kişi sorumlu olmalıdır.
3. Belirlenen moleküler alan için kullanım ve temizlik tavsiyeleri
PCR Öncesi: Reaktif alikotlama/mastermix hazırlama: Bu, moleküler deneylerin hazırlanmasında kullanılan tüm alanların en temizi olmalı ve ideal olarak UV ışığı ile donatılmış, özel olarak ayrılmış bir laminar akış kabini olmalıdır. Numuneler, ekstrakte edilmiş nükleik asit ve amplifikasyonlu PCR ürünleri bu alanda kullanılmamalıdır. Amplifikasyon reaktifleri, aynı özel alanda, tercihen laminar akış kabini veya PCR öncesi alanının yanında, bir dondurucuda (veya üretici önerilerine göre buzdolabında) saklanmalıdır. PCR öncesi alana veya laminar akış kabinine her girişte eldivenler değiştirilmelidir.
PCR öncesi alan veya laminar akış kabini, kullanımdan önce ve sonra aşağıdaki şekilde temizlenmelidir: Kabindeki tüm eşyaları (örneğin pipetler, uç kutuları, vorteks, santrifüj, tüp rafları, kalemler vb.) %70 etanol veya ticari bir DNA yok edici dekontaminantla silin ve kurumaya bırakın. Laminar akış kabini gibi kapalı bir çalışma alanında, davlumbazı 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.
Not
Reaktifleri UV ışığına maruz bırakmayın; kabin temizlendikten sonra kabine alın. Ters transkripsiyon PCR yapıyorsanız, yüzeyleri ve ekipmanları temas halinde RNazları parçalayan bir solüsyonla silmek de faydalı olabilir. Bu, RNA'nın enzimle parçalanmasından kaynaklanan yanlış negatif sonuçların önlenmesine yardımcı olabilir. Dekontaminasyondan sonra ve mastermix hazırlanmadan önce eldivenler bir kez daha değiştirilmeli ve kabin kullanıma hazır hale gelmelidir.
Pre-PCR: Nükleik asit ekstraksiyonu/şablon eklenmesi:
Nükleik asit, ayrı bir pipet seti, filtre uçları, tüp rafları, temiz eldivenler, laboratuvar önlükleri ve diğer ekipmanlar kullanılarak ikinci bir belirlenmiş alanda çıkarılmalı ve işlenmelidir. Bu alan aynı zamanda ana karışım tüplerine veya plakalarına şablon, kontroller ve eğilim çizgilerinin eklenmesi içindir. Analiz edilen çıkarılmış nükleik asit örneklerinin kontaminasyonunu önlemek için, pozitif kontroller veya standartlarla çalışmadan önce eldivenlerin değiştirilmesi ve ayrı bir pipet seti kullanılması önerilir. PCR reaktifleri ve amplifiye ürünler bu alanda pipetlenmemelidir. Örnekler aynı alandaki belirlenmiş buzdolaplarında veya dondurucularda saklanmalıdır. Örnek çalışma alanı, ana karışım alanıyla aynı şekilde temizlenmelidir.
PCR Sonrası: Amplifikasyon ve amplifikasyon edilen ürünün işlenmesi
Bu belirlenmiş alan, amplifikasyon sonrası işlemler içindir ve PCR öncesi alanlardan fiziksel olarak ayrı olmalıdır. Genellikle termosiklerler ve gerçek zamanlı platformlar içerir ve ideal olarak, iç içe PCR gerçekleştiriliyorsa, 1. tur PCR ürününü 2. tur reaksiyonuna eklemek için laminar akışlı bir kabine sahip olmalıdır. Kontaminasyon riski yüksek olduğundan, PCR reaktifleri ve ekstrakte edilmiş nükleik asit bu alanda kullanılmamalıdır. Bu alanda ayrı bir eldiven seti, laboratuvar önlüğü, plak ve tüp rafları, pipetler, filtre uçları, hazneler ve diğer ekipmanlar bulunmalıdır. Tüpler açılmadan önce santrifüj edilmelidir. Numune çalışma alanı, mastermix alanıyla aynı şekilde temizlenmelidir.
PCR Sonrası: Ürün analizi
Bu oda, jel elektroforez tankları, güç kaynakları, UV transillüminatör ve jel dokümantasyon sistemi gibi ürün tespit ekipmanları içindir. Bu alanda ayrı eldiven setleri, laboratuvar önlükleri, plaka ve tüp rafları, pipetler, filtre uçları, hazneler ve diğer ekipmanlar bulunmalıdır. Yükleme boyası, moleküler belirteç ve agaroz jeli ile tampon bileşenleri dışında bu alana başka reaktif getirilemez. Numune çalışma alanı, ana karışım alanıyla aynı şekilde temizlenmelidir.
Önemli not
İdeal olarak, PCR sonrası odalarda daha önce çalışma yapılmışsa, PCR öncesi odalara aynı gün girilmemelidir. Bu tamamen kaçınılmazsa, önce ellerin iyice yıkandığından ve odalarda özel laboratuvar önlüklerinin giyildiğinden emin olun. PCR sonrası odalarda kullanılmış laboratuvar defterleri ve evrakları, PCR öncesi odalara alınmamalıdır; gerekirse, protokollerin/numune kimliklerinin vb. çıktılarını alın.
4. Genel moleküler biyoloji tavsiyeleri
Test inhibisyonunu önlemek için pudrasız eldiven kullanın. Doğru pipetleme tekniği, kontaminasyonu azaltmak için çok önemlidir. Yanlış pipetleme, sıvıları dağıtırken sıçramaya ve aerosol oluşumuna neden olabilir. Doğru pipetleme için iyi uygulamalar şu bağlantılarda bulunabilir: Gilson pipetleme kılavuzu, Anachem pipetleme tekniği videoları, Tüpleri açmadan önce santrifüjleyin ve sıçramayı önlemek için dikkatlice açın. Kirletici maddelerin girişini önlemek için tüpleri kullanımdan hemen sonra kapatın.
Birden fazla reaksiyon gerçekleştirirken, reaktif transfer sayısını en aza indirmek ve kontaminasyon riskini azaltmak için yaygın reaktifler (örneğin su, dNTP'ler, tampon, primerler ve enzim) içeren tek bir ana karışım hazırlayın. Ana karışımı buz veya soğuk bir blok üzerine yerleştirmeniz önerilir. Sıcak Başlatma enzimi kullanımı, spesifik olmayan ürünlerin üretimini azaltmaya yardımcı olabilir. Bozunmayı önlemek için floresan prob içeren reaktifleri ışıktan koruyun.
5. İç kontroller
Tüm reaksiyonlarda şablonsuz bir kontrol ve kantitatif reaksiyonlar için çok noktalı titre edilmiş bir trend çizgisinin yanı sıra, iyi karakterize edilmiş, doğrulanmış pozitif ve negatif kontrolleri ekleyin. Pozitif kontrol, kontaminasyon riski oluşturacak kadar güçlü olmamalıdır. Nükleik asit ekstraksiyonu yaparken pozitif ve negatif ekstraksiyon kontrollerini ekleyin.
Kullanıcıların davranış kurallarından haberdar olması için her alana açık talimatlar asılması önerilir. Klinik örneklerde çok düşük seviyelerde DNA veya RNA tespit eden tanı laboratuvarları, PCR öncesi odalarda hafif pozitif hava basıncı ve PCR sonrası odalarda hafif negatif hava basıncı olan ayrı hava işleme sistemlerine sahip olmak gibi ek bir güvenlik önlemi benimsemek isteyebilirler.
Son olarak, bir kalite güvence (KG) planı geliştirmek faydalıdır. Böyle bir plan, reaktif ana stokları ve çalışma stoklarının listelerini, kit ve reaktiflerin depolanma kurallarını, kontrol sonuçlarının raporlanmasını, personel eğitim programlarını, sorun giderme algoritmalarını ve gerektiğinde düzeltici eylemleri içermelidir.
6. Kaynakça
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bölüm 3: Bir qPCR laboratuvarı kurulması. USEPA qPCR yöntemi 1611 kullanılarak rekreasyonel suların test edilmesine yönelik bir kılavuz belge. Lansing-Michigan Eyalet Üniversitesi.
İngiltere Halk Sağlığı, NHS. Mikrobiyoloji araştırmaları için İngiltere standartları: Moleküler amplifikasyon testleri gerçekleştirirken İyi Laboratuvar Uygulamaları. Kalite Rehberi. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR laboratuvarının kurulması. Cold Spring Harb Protokolü. 2007;7.
Schroeder S 2013. Santrifüjlerin rutin bakımı: Santrifüjlerin, rotorların ve adaptörlerin temizliği, bakımı ve dezenfeksiyonu (Beyaz Kitap No. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Tanı laboratuvarlarında kullanılan moleküler tabanlı testler için İyi Klinik Laboratuvar Uygulamaları (GCLP), Akyar I, editör. Geniş kalite kontrol spektrumları. Rijeka, Hırvatistan: Intech; 2011: 29–52.
Gönderi zamanı: 16 Temmuz 2020
