Молекуларне методе детекције имају могућност производње велике количине нуклеинских киселина кроз амплификацију трагова пронађених у узорцима. Иако је ово корисно за омогућавање осетљиве детекције, такође уводи могућност контаминације ширењем амплификационих аеросола у лабораторијском окружењу. Приликом спровођења експеримената, могу се предузети мере како би се избегла контаминација реагенса, лабораторијске опреме и радног простора, јер таква контаминација може генерисати лажно позитивне (или лажно негативне) резултате.
Да би се смањила вероватноћа контаминације, Добра лабораторијска пракса треба да се примењује у сваком тренутку. Конкретно, треба предузети мере предострожности у вези са следећим тачкама:
1. Руковање реагенсима
2. Организација радног простора и опреме
3. Савети за употребу и чишћење одређеног молекуларног простора
4. Општи савети из молекуларне биологије
5. Интерне контроле
6. Библиографија
1. Руковање реагенсима
Пре отварања, кратко центрифугирајте епрувете са реагенсима како бисте избегли стварање аеросола. Аликвотирајте реагенсе како бисте избегли вишеструко замрзавање и одмрзавање и контаминацију главних залиха. Јасно означите и датирајте све епрувете са реагенсима и реакцијама и водите евиденцију бројева серија и партија реагенса коришћених у свим експериментима. Пипетирајте све реагенсе и узорке користећи филтер врхове. Пре куповине, препоручљиво је да се потврди са произвођачем да ли филтер врхови одговарају марки пипете која ће се користити.
2. Организација радног простора и опреме
Радни простор треба да буде организован тако да се осигура да ток рада одвија у једном смеру, од чистих просторија (пре ПЦР) до прљавих просторија (после ПЦР). Следеће опште мере предострожности ће помоћи у смањењу шансе за контаминацију. Имати одвојене одређене просторије, или барем физички одвојене просторе, за: припрему мастермикса, екстракцију нуклеинских киселина и додавање ДНК шаблона, амплификацију и руковање амплификованим производом и анализу производа, нпр. гел електрофореза.
У неким условима, тешко је имати 4 одвојене просторије. Могућа, али мање пожељна опција је да се припрема мастермикса изврши у заштићеном простору, нпр. у ламинарном кабинету. У случају угнежђене ПЦР амплификације, припрема мастермикса за другу рунду реакције треба да се изврши у „чистом“ простору за припрему мастермикса, али инокулација примарним ПЦР производом треба да се изврши у просторији за амплификацију, и ако је могуће у посебном заштићеном простору (нпр. у ламинарном кабинету).
Свака соба/просторија захтева посебан сет јасно обележених пипета, врхова филтера, сталака за епрувете, вртлога, центрифуга (ако је потребно), оловки, генеричких лабораторијских реагенса, лабораторијских мантила и кутија рукавица које ће остати на њиховим одговарајућим радним местима. Руке се морају опрати, а рукавице и лабораторијски мантили се мењају приликом кретања између одређених простора. Реагенси и опрема не смеју се премештати из прљавог у чисти простор. Уколико дође до екстремног случаја где реагенс или део опреме треба померити уназад, прво се мора деконтаминирати са 10% натријум хипохлоритом, а затим обрисати стерилном водом.
Напомена
Раствор натријум хипохлорита од 10% мора се припремати свеж свакодневно. Када се користи за деконтаминацију, треба се придржавати минималног времена контакта од 10 минута.
Алтернативно, комерцијално доступни производи који су валидирани као површинска деконтаминанса која уништавају ДНК могу се користити ако локалне безбедносне препоруке не дозвољавају употребу натријум хипохлорита или ако натријум хипохлорит није погодан за деконтаминацију металних делова опреме.
Идеално би било да се особље придржава етоса једносмерног тока рада и да се не враћа из прљавих просторија (после ПЦР-а) у чисте просторе (пре ПЦР-а) истог дана. Међутим, могу постојати случајеви када је то неизбежно. Када се таква прилика укаже, особље мора водити рачуна да темељно опере руке, промени рукавице, користи одређени лабораторијски мантил и не уноси никакву опрему коју ће желети поново да изнесу из просторије, као што су лабораторијске књиге. Такве контролне мере треба нагласити у обуци особља о молекуларним методама.
Након употребе, радне површине треба очистити са 10% натријум хипохлоритом (након чега следи стерилна вода да би се уклонили остаци избељивача), 70% етанолом или валидираним, комерцијално доступним деконтаминантом који уништава ДНК. Идеално би било да се инсталирају ултраљубичасте (УВ) лампе како би се омогућила деконтаминација зрачењем. Међутим, употреба УВ лампи треба да буде ограничена на затворене радне просторе, нпр. заштитне ормаре, како би се ограничило излагање УВ зрачењу лабораторијског особља. Молимо вас да се придржавате упутстава произвођача за одржавање УВ лампи, вентилацију и чишћење како бисте осигурали да лампе остану ефикасне.
Ако се користи 70% етанол уместо натријум хипохлорита, биће потребно зрачење УВ светлошћу да би се деконтаминација завршила.
Не чистите вртлог и центрифугу натријум хипохлоритом; уместо тога, обришите са 70% етанолом и изложите УВ светлу или користите комерцијално средство за деконтаминацију које уништава ДНК. У случају просипања, обратите се произвођачу за додатне савете о чишћењу. Ако упутства произвођача то дозвољавају, пипете треба рутински стерилисати у аутоклаву. Ако се пипете не могу аутоклавирати, довољно је очистити их са 10% натријум хипохлоритом (након чега следи темељно брисање стерилном водом) или комерцијалним средством за деконтаминацију које уништава ДНК, а затим излагање УВ зрачењу.
Чишћење високопроцентним натријум хипохлоритом може на крају оштетити пластику и метал пипета ако се обавља редовно; прво проверите препоруке произвођача. Сву опрему треба редовно калибрисати према распореду који препоручује произвођач. Одређена особа треба да буде задужена да осигура да се распоред калибрације поштује, да се воде детаљни дневници и да су сервисне етикете јасно истакнуте на опреми.
3. Савети за употребу и чишћење одређеног молекуларног простора
Пре-ПЦР: Аликвотирање реагенса / припрема мастермикса: Ово би требало да буде најчистији од свих простора који се користе за припрему молекуларних експеримената и идеално би требало да буде одређени ламинарни кабинет опремљен УВ светлом. Узорци, екстрахована нуклеинска киселина и амплификовани ПЦР производи не смеју се руковати у овом простору. Амплификациони реагенси треба да се чувају у замрзивачу (или фрижидеру, према препорукама произвођача) у истом одређеном простору, идеално поред ламинарног кабинета или простора за пре-ПЦР. Рукавице треба мењати сваки пут при уласку у простор за пре-ПЦР или ламинарни кабинет.
Пре-PCR простор или ламинарни кабинет треба очистити пре и после употребе на следећи начин: Обришите све предмете у кабинету, нпр. пипете, кутије за врхове, вртлог, центрифугу, сталак за епрувете, оловке итд. са 70% етанолом или комерцијалним деконтаминантом који уништава ДНК и оставите да се осуши. У случају затвореног радног простора, нпр. ламинарног кабинета, изложите поклопац УВ светлу 30 минута.
Напомена
Не излажите реагенсе УВ зрачењу; преместите их у ормарић тек када се очисти. Ако се изводи ПЦР са реверзном транскрипцијом, може бити корисно и обрисати површине и опрему раствором који разграђује РНКазе при контакту. Ово може помоћи у избегавању лажно негативних резултата од ензимске разградње РНК. Након деконтаминације и пре припреме мастермикса, рукавице треба још једном променити, а затим је ормарић спреман за употребу.
Пре-PCR: Екстракција нуклеинских киселина/додавање шаблона:
Нуклеинска киселина мора се екстраховати и руковати њоме у другом одређеном простору, користећи посебан сет пипета, врхова филтера, сталака за епрувете, нових рукавица, лабораторијских мантила и друге опреме. Овај простор је такође намењен за додавање шаблона, контрола и линија тренда у епрувете или плоче са мастермиксом. Да би се избегла контаминација екстрахованих узорака нуклеинских киселина који се анализирају, препоручује се промена рукавица пре руковања позитивним контролама или стандардима и коришћење посебног сета пипета. ПЦР реагенси и амплификовани производи не смеју се пипетирати у овом простору. Узорке треба чувати у одређеним фрижидерима или замрзивачима у истом простору. Радни простор за узорке треба чистити на исти начин као и простор са мастермиксом.
Пост-ПЦР: Амплификација и руковање амплификованим производом
Овај наменски простор је намењен за процесе након амплификације и требало би да буде физички одвојен од простора за пре-ПЦР. Обично садржи термоциклере и платформе у реалном времену, а идеално би било да има ламинарни кабинет за додавање ПЦР производа из прве рунде у реакцију друге рунде, ако се изводи угнежђена ПЦР. ПЦР реагенси и екстрахована нуклеинска киселина не смеју се руковати у овом простору јер је ризик од контаминације висок. Овај простор треба да има посебан сет рукавица, лабораторијских мантила, сталака за плоче и епрувете, пипета, врхова филтера, канти и друге опреме. Епрувете морају бити центрифугиране пре отварања. Радни простор за узорке треба очистити на исти начин као и простор за мастермикс.
Пост-ПЦР: Анализа производа
Ова просторија је намењена за опрему за детекцију производа, нпр. резервоаре за гел електрофорезу, батерије, УВ трансилуминатор и систем за документовање гелова. Овај простор треба да има одвојене комплете рукавица, лабораторијске мантиле, сталаке за плоче и епрувете, пипете, врхове филтера, канте и другу опрему. Ниједан други реагенс се не сме уносити у овај простор, осим боје за пуњење, молекуларног маркера и агарозног гела, као и компоненти пуфера. Радни простор за узорке треба чистити на исти начин као и простор за мастермеш.
Важна напомена
Идеално би било да се у просторије за пре-PCR не улази истог дана ако је рад већ обављен у просторијама за пост-PCR. Ако је то потпуно неизбежно, осигурајте да се руке прво темељно оперу и да се у просторијама носе посебни лабораторијски мантили. Лабораторијске књиге и папирологија не смеју се уносити у просторије за пре-PCR ако су коришћени у просторијама за пост-PCR; ако је потребно, направите дупликате одштампаних протокола/идентификационих бројева узорака итд.
4. Општи савети из молекуларне биологије
Користите рукавице без пудера како бисте избегли инхибицију анализе. Исправна техника пипетирања је од највеће важности за смањење контаминације. Неправилно пипетирање може довести до прскања приликом дозирања течности и стварања аеросола. Добра пракса за правилно пипетирање може се наћи на следећим линковима: Гилсонов водич за пипетирање, Анахемови видео снимци о техници пипетирања, Центрифугирајте епрувете пре отварања и пажљиво их отворите како бисте избегли прскање. Затворите епрувете одмах након употребе како бисте избегли унос контаминанта.
Приликом извођења вишеструких реакција, припремите један мастермикс који садржи уобичајене реагенсе (нпр. воду, dNTP-ове, пуфер, прајмере и ензим) како бисте минимизирали број преноса реагенса и смањили опасност од контаминације. Препоручује се да се мастермикс постави на лед или хладни блок. Употреба ензима за врући старт може помоћи у смањењу производње неспецифичних производа. Заштитите реагенсе који садрже флуоресцентне сонде од светлости како бисте избегли њихову деградацију.
5. Интерне контроле
Укључите добро окарактерисане, потврђене позитивне и негативне контроле, заједно са контролом без шаблона у свим реакцијама и вишетачкастом титрираном линијом тренда за квантитативне реакције. Позитивна контрола не би требало да буде толико јака да представља ризик од контаминације. Укључите позитивне и негативне контроле екстракције када вршите екстракцију нуклеинских киселина.
Препоручује се да се јасна упутства истакну у свакој од области како би корисници били упознати са правилима понашања. Дијагностичке лабораторије које откривају веома ниске нивое ДНК или РНК у клиничким узорцима могу желети да усвоје додатну безбедносну меру у виду одвојених система за управљање ваздухом са благо позитивним ваздушним притиском у просторијама пре ПЦР-а и благо негативним ваздушним притиском у просторијама после ПЦР-а.
Коначно, корисно је развити план обезбеђења квалитета (ОК). Такав план треба да садржи листе главних и радних залиха реагенса, правила за складиштење комплета и реагенса, извештавање о резултатима контроле, програме обуке особља, алгоритме за решавање проблема и корективне мере када је то потребно.
6. Библиографија
Аслан А, Кинзелман Ј, Дрелин Е, Анањева Т, Лавандер Ј. Поглавље 3: Оснивање qPCR лабораторије. Упутство за испитивање рекреативних вода коришћењем USEPA qPCR методе 1611. Лансинг - Државни универзитет у Мичигену.
Јавно здравство Енглеске, НХС. Стандарди Уједињеног Краљевства за микробиолошка истраживања: Добра лабораторијска пракса при извођењу тестова молекуларне амплификације). Смернице за квалитет. 2013;4(4):1–15.
Мифлин Т. Оснивање ПЦР лабораторије. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шредер С 2013. Рутинско одржавање центрифуга: чишћење, одржавање и дезинфекција центрифуга, ротора и адаптера (Бела књига бр. 14). Хамбург: Епендорф; 2013.
Виана РВ, Валис КЛ. Добра клиничка лабораторијска пракса (GCLP) за молекуларно засноване тестове који се користе у дијагностичким лабораторијама, У: Акјар И, уредник. Широк спектар контроле квалитета. Ријека, Хрватска: Intech; 2011: 29–52.
Време објаве: 16. јул 2020.
