Molekylære deteksjonsmetoder har evnen til å produsere et stort volum nukleinsyre gjennom amplifisering av spormengder som finnes i prøver. Selv om dette er gunstig for å muliggjøre sensitiv deteksjon, introduserer det også muligheten for kontaminering gjennom spredning av amplifiseringsaerosoler i laboratoriemiljøet. Ved utførelse av eksperimenter kan det iverksettes tiltak for å unngå kontaminering av reagenser, laboratorieutstyr og benkeplass, da slik kontaminering kan generere falskt positive (eller falskt negative) resultater.
For å redusere sannsynligheten for kontaminering, bør god laboratoriepraksis praktiseres til enhver tid. Spesielt bør forholdsregler tas angående følgende punkter:
1. Håndtering av reagenser
2. Organisering av arbeidsplass og utstyr
3. Bruks- og rengjøringsråd for det angitte molekylære rommet
4. Generelle råd om molekylærbiologi
5. Internkontroll
6. Bibliografi
1. Håndtering av reagenser
Sentrifuger reagensrørene kort før åpning for å unngå dannelse av aerosoler. Alikvoter reagenser for å unngå gjentatt frysing og tining og kontaminering av masterstokkene. Merk og dater alle reagens- og reaksjonsrør tydelig, og før logg over reagenslot- og batchnumre som brukes i alle eksperimenter. Pipetter alle reagenser og prøver med filterspisser. Før kjøp anbefales det å bekrefte med produsenten at filterspissene passer til pipettemerket som skal brukes.
2. Organisering av arbeidsplass og utstyr
Arbeidsområdet bør organiseres for å sikre at arbeidsflyten skjer i én retning, fra rene områder (før PCR) til skitne områder (etter PCR). Følgende generelle forholdsregler vil bidra til å redusere sjansen for kontaminering. Ha separate rom, eller som et minimum fysisk adskilte områder, for: klargjøring av mastermiks, nukleinsyreekstraksjon og tilsetning av DNA-mal, amplifisering og håndtering av amplifisert produkt, og produktanalyse, f.eks. gelelektroforese.
I noen settinger er det vanskelig å ha fire separate rom. Et mulig, men mindre ønskelig alternativ, er å gjøre mastermiks-prepareringen i et inneslutningsområde, f.eks. et laminært strømningsskap. Ved nestet PCR-amplifikasjon bør prepareringen av mastermiksen for den andre runden av reaksjonen prepareres i det «rene» området for mastermikspreparering, men inokuleringen med det primære PCR-produktet bør gjøres i amplifikasjonsrommet, og om mulig i et dedikert inneslutningsområde (f.eks. et laminært strømningsskap).
Hvert rom/område trenger et separat sett med tydelig merkede pipetter, filterspisser, rørstativer, virvler, sentrifuger (hvis relevant), penner, generiske laboratoriereagenser, laboratoriefrakker og esker med hansker som skal forbli på de respektive arbeidsstasjonene. Hender må vaskes og hansker og laboratoriefrakker skiftes når man flytter mellom de angitte områdene. Reagenser og utstyr skal ikke flyttes fra et skittent område til et rent område. Skulle det oppstå et ekstremt tilfelle der et reagens eller utstyr må flyttes bakover, må det først dekontamineres med 10 % natriumhypokloritt, etterfulgt av avtørking med sterilt vann.
Note
10 % natriumhypoklorittløsningen må lages fersk daglig. Ved bruk til dekontaminering bør en minimum kontakttid på 10 minutter overholdes.
Alternativt kan kommersielt tilgjengelige produkter som er validert som DNA-ødeleggende overflatedekontamineringsmidler brukes dersom lokale sikkerhetsanbefalinger ikke tillater bruk av natriumhypokloritt, eller dersom natriumhypokloritt ikke er egnet for dekontaminering av metalldeler på utstyr.
Ideelt sett bør personalet følge den enveisbaserte arbeidsflyten og ikke gå fra skitne områder (etter PCR) tilbake til rene områder (før PCR) samme dag. Det kan imidlertid være tilfeller der dette er uunngåelig. Når slike tilfeller oppstår, må personalet sørge for å vaske hendene grundig, skifte hansker, bruke den angitte laboratoriefrakken og ikke ta med seg utstyr de ønsker å ta ut av rommet igjen, for eksempel laboratoriebøker. Slike kontrolltiltak bør vektlegges i opplæringen av personalet i molekylære metoder.
Etter bruk bør benkeplassene rengjøres med 10 % natriumhypokloritt (etterfulgt av sterilt vann for å fjerne gjenværende blekemiddel), 70 % etanol eller et validert kommersielt tilgjengelig DNA-ødeleggende dekontamineringsmiddel. Ideelt sett bør ultrafiolette (UV) lamper monteres for å muliggjøre dekontaminering ved bestråling. Bruk av UV-lamper bør imidlertid begrenses til lukkede arbeidsområder, f.eks. sikkerhetsskap, for å begrense laboratoriepersonalets UV-eksponering. Følg produsentens instruksjoner for stell av UV-lamper, ventilasjon og rengjøring for å sikre at lampene forblir effektive.
Hvis du bruker 70 % etanol i stedet for natriumhypokloritt, vil bestråling med UV-lys være nødvendig for å fullføre dekontamineringen.
Ikke rengjør vortexen og sentrifugen med natriumhypokloritt; tørk i stedet av med 70 % etanol og utsett for UV-lys, eller bruk et kommersielt DNA-ødeleggende dekontamineringsmiddel. Ved søl, sjekk med produsenten for ytterligere rengjøringsråd. Hvis produsentens instruksjoner tillater det, bør pipetter rutinemessig steriliseres med autoklav. Hvis pipetter ikke kan autoklaveres, bør det være tilstrekkelig å rengjøre dem med 10 % natriumhypokloritt (etterfulgt av grundig avtørking med sterilt vann) eller med et kommersielt DNA-ødeleggende dekontamineringsmiddel etterfulgt av UV-eksponering.
Rengjøring med høyprosent natriumhypokloritt kan etter hvert skade pipettenes plast og metaller hvis det gjøres regelmessig. Sjekk produsentens anbefalinger først. Alt utstyr må kalibreres regelmessig i henhold til produsentens anbefalte plan. En utpekt person bør være ansvarlig for å sikre at kalibreringsplanen overholdes, at detaljerte logger føres og at serviceetiketter vises tydelig på utstyret.
3. Bruks- og rengjøringsråd for det angitte molekylære rommet
Pre-PCR: Reagensalikvotering / mastermiks-preparering: Dette bør være det reneste av alle områdene som brukes til preparering av molekylære eksperimenter, og bør ideelt sett være et dedikert laminært strømningsskap utstyrt med UV-lys. Prøver, ekstrahert nukleinsyre og amplifiserte PCR-produkter må ikke håndteres i dette området. Amplifikasjonsreagenser bør oppbevares i en fryser (eller kjøleskap, i henhold til produsentens anbefalinger) i samme angitte rom, ideelt sett ved siden av laminært strømningsskap eller pre-PCR-område. Hansker bør skiftes hver gang man går inn i pre-PCR-området eller laminært strømningsskap.
Pre-PCR-området eller laminærstrømningsskapet bør rengjøres før og etter bruk på følgende måte: Tørk av alle gjenstander i skapet, f.eks. pipetter, spissbokser, vortex, sentrifuge, rørstativer, penner osv. med 70 % etanol eller et kommersielt DNA-ødeleggende dekontamineringsmiddel, og la det tørke. Ved et lukket arbeidsområde, f.eks. et laminærstrømningsskap, utsett hetten for UV-lys i 30 minutter.
Note
Ikke utsett reagenser for UV-lys; flytt dem bare inn i skapet når det er rent. Hvis du utfører revers transkripsjons-PCR, kan det også være nyttig å tørke av overflater og utstyr med en løsning som bryter ned RNaser ved kontakt. Dette kan bidra til å unngå falskt negative resultater fra enzymnedbrytning av RNA. Etter dekontaminering og før tilberedning av mastermiksen, bør hanskene skiftes på nytt, og deretter er skapet klart til bruk.
Pre-PCR: Ekstraksjon av nukleinsyre/tilsetning av mal:
Nukleinsyre må ekstraheres og håndteres i et annet, angitt område, ved bruk av et separat sett med pipetter, filterspisser, rørstativer, rene hansker, laboratoriefrakker og annet utstyr. Dette området er også for tilsetning av mal, kontroller og trendlinjer til mastermix-rørene eller -platene. For å unngå kontaminering av de ekstraherte nukleinsyreprøvene som analyseres, anbefales det å bytte hansker før håndtering av positive kontroller eller standarder, og å bruke et separat sett med pipetter. PCR-reagenser og amplifiserte produkter må ikke pipetteres i dette området. Prøver bør oppbevares i angitte kjøleskap eller frysere i samme område. Prøvearbeidsområdet bør rengjøres på samme måte som mastermix-området.
Post-PCR: Amplifikasjon og håndtering av det amplifiserte produktet
Dette dedikerte rommet er for postamplifikasjonsprosesser og bør være fysisk atskilt fra pre-PCR-områdene. Det inneholder vanligvis termosyklere og sanntidsplattformer, og ideelt sett bør det ha et laminært strømningsskap for å tilsette runde 1 PCR-produktet til runde 2-reaksjonen, hvis nestet PCR utføres. PCR-reagenser og ekstrahert nukleinsyre må ikke håndteres i dette området, da risikoen for kontaminering er høy. Dette området bør ha et separat sett med hansker, laboratoriefrakker, plate- og rørstativer, pipetter, filterspisser, beholdere og annet utstyr. Rørene må sentrifugeres før åpning. Prøvearbeidsområdet bør rengjøres på samme måte som mastermiksrommet.
Post-PCR: Produktanalyse
Dette rommet er for produktdeteksjonsutstyr, f.eks. gelelektroforesetanker, strømforsyninger, UV-transilluminator og geldokumentasjonssystem. Dette området skal ha separate sett med hansker, laboratoriefrakker, plate- og rørstativer, pipetter, filterspisser, beholdere og annet utstyr. Ingen andre reagenser kan bringes inn i dette området, unntatt lastefargestoff, molekylær markør og agarosegel, samt bufferkomponenter. Prøvearbeidsområdet skal rengjøres på samme måte som mastermiksområdet.
Viktig merknad
Ideelt sett bør man ikke gå inn i pre-PCR-rommene samme dag som det allerede er utført arbeid i post-PCR-rommene. Hvis dette er helt uunngåelig, må man sørge for at hendene vaskes grundig først, og at det brukes spesifikke laboratoriefrakker i rommene. Laboratoriebøker og papirer må ikke tas med inn i pre-PCR-rommene hvis de har blitt brukt i post-PCR-rommene. Ta om nødvendig kopier av protokoller/prøve-ID-er osv.
4. Generelle råd om molekylærbiologi
Bruk pudderfrie hansker for å unngå hemming av analysen. Riktig pipetteringsteknikk er avgjørende for å redusere kontaminering. Feil pipettering kan føre til sprut ved dispensering av væsker og dannelse av aerosoler. God praksis for korrekt pipettering finner du på følgende lenker: Gilson-veiledning for pipetting, Anachem-pipetteringsteknikkvideoer, Sentrifugerør før åpning, og åpne dem forsiktig for å unngå sprut. Lukk rørene umiddelbart etter bruk for å unngå innføring av forurensninger.
Når du utfører flere reaksjoner, må du lage én mastermiks som inneholder vanlige reagenser (f.eks. vann, dNTP-er, buffer, primere og enzym) for å minimere antall reagensoverføringer og redusere risikoen for kontaminering. Det anbefales å sette opp mastermiksen på is eller en kaldblokk. Bruk av et Hot Start-enzym kan bidra til å redusere produksjonen av uspesifikke produkter. Beskytt reagenser som inneholder fluorescerende prober mot lys for å unngå nedbrytning.
5. Internkontroll
Inkluder godt karakteriserte, bekreftede positive og negative kontroller, sammen med en kontroll uten mal i alle reaksjoner, og en flerpunkts titrert trendlinje for kvantitative reaksjoner. Den positive kontrollen bør ikke være så sterk at den utgjør en kontamineringsrisiko. Inkluder positive og negative ekstraksjonskontroller når du utfører nukleinsyreekstraksjon.
Det anbefales at det slås opp tydelige instruksjoner i hvert område, slik at brukerne er klar over reglene for oppførsel. Diagnostiske laboratorier som oppdager svært lave nivåer av DNA eller RNA i kliniske prøver, kan ønske å ta i bruk det ekstra sikkerhetstiltaket med å ha separate lufthåndteringssystemer med svakt positivt lufttrykk i rommene før PCR og svakt negativt lufttrykk i rommene etter PCR.
Til slutt er det nyttig å utvikle en kvalitetssikringsplan (QA). En slik plan bør inneholde lister over reagensstamlager og arbeidslager, regler for oppbevaring av sett og reagenser, rapportering av kontrollresultater, opplæringsprogrammer for ansatte, feilsøkingsalgoritmer og utbedringstiltak ved behov.
6. Bibliografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapittel 3: Oppsett av et qPCR-laboratorium. Et veiledningsdokument for testing av rekreasjonsvann ved bruk av USEPA qPCR-metode 1611. Lansing-Michigan State University.
Public Health England, NHS. Britiske standarder for mikrobiologiske undersøkelser: God laboratoriepraksis ved utførelse av molekylære amplifiseringsanalyser. Kvalitetsveiledning. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Oppsett av et PCR-laboratorium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutinemessig vedlikehold av sentrifuger: rengjøring, vedlikehold og desinfisering av sentrifuger, rotorer og adaptere (Hvitbok nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. God klinisk laboratoriepraksis (GCLP) for molekylærbaserte tester brukt i diagnostiske laboratorier, I: Akyar I, redaktør. Bredt spekter av kvalitetskontroll. Rijeka, Kroatia: Intech; 2011: 29–52.
Publisert: 16. juli 2020
