Moleculaire detectiemethoden kunnen een grote hoeveelheid nucleïnezuur produceren door de amplificatie van sporenhoeveelheden die in monsters worden aangetroffen. Hoewel dit gunstig is voor gevoelige detectie, brengt het ook de mogelijkheid van besmetting met zich mee door de verspreiding van amplificatie-aerosolen in de laboratoriumomgeving. Bij het uitvoeren van experimenten kunnen maatregelen worden genomen om besmetting van reagentia, laboratoriumapparatuur en werktafels te voorkomen, aangezien dergelijke besmetting vals-positieve (of vals-negatieve) resultaten kan opleveren.
Om de kans op besmetting te verkleinen, moet te allen tijde Goede Laboratoriumpraktijk worden toegepast. Specifiek moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen met betrekking tot de volgende punten:
1. Omgaan met reagentia
2. Organisatie van de werkruimte en de apparatuur
3. Gebruiks- en reinigingsadvies voor de aangewezen moleculaire ruimte
4. Algemeen advies over moleculaire biologie
5. Interne controles
6. Bibliografie
1. Omgaan met reagentia
Centrifugeer de reageerbuisjes kort voor het openen om aerosolvorming te voorkomen. Verdeel de reagentia in aliquots om herhaaldelijk invriezen en ontdooien en besmetting van de masterstock te voorkomen. Label en dateer alle reageerbuisjes en reageerbuisjes duidelijk en houd een logboek bij van de lot- en batchnummers van de reagentia die in alle experimenten zijn gebruikt. Pipetteer alle reagentia en monsters met behulp van filtertips. Controleer vóór aankoop bij de fabrikant of de filtertips passen bij het merk pipet dat u wilt gebruiken.
2. Organisatie van de werkruimte en de apparatuur
De werkruimte moet zo worden georganiseerd dat de werkstroom in één richting verloopt, van schone ruimtes (vóór de PCR) naar vuile ruimtes (na de PCR). De volgende algemene voorzorgsmaatregelen helpen de kans op besmetting te verkleinen. Zorg voor aparte, aangewezen ruimtes, of ten minste fysiek gescheiden ruimtes, voor: de bereiding van mastermix, de extractie van nucleïnezuur en het toevoegen van DNA-templates, de amplificatie en verwerking van geamplificeerd product, en productanalyse, bijvoorbeeld gelelektroforese.
In sommige situaties is het lastig om vier aparte ruimtes te hebben. Een mogelijke, maar minder wenselijke optie is om de mastermix te bereiden in een afgesloten ruimte, bijvoorbeeld een laminaire flowkast. In het geval van geneste PCR-amplificatie moet de bereiding van de mastermix voor de tweede ronde plaatsvinden in de 'schone' ruimte voor de mastermixbereiding, maar de inoculatie met het primaire PCR-product moet plaatsvinden in de amplificatieruimte, en indien mogelijk in een speciale afgesloten ruimte (bijvoorbeeld een laminaire flowkast).
Elke kamer/ruimte heeft een aparte set duidelijk gelabelde pipetten, filtertips, buisrekken, vortexen, centrifuges (indien van toepassing), pennen, generieke laboratoriumreagentia, labjassen en dozen handschoenen nodig die op de betreffende werkplekken blijven. Handen moeten worden gewassen en handschoenen en labjassen moeten worden vervangen bij verplaatsing tussen de aangewezen ruimtes. Reagentia en apparatuur mogen niet van een vuile naar een schone ruimte worden verplaatst. Mocht zich een extreem geval voordoen waarbij een reagens of apparaat achteruit moet worden verplaatst, dan moet het eerst worden ontsmet met 10% natriumhypochloriet en vervolgens worden afgenomen met steriel water.
Opmerking
De 10% natriumhypochlorietoplossing moet dagelijks vers worden bereid. Bij gebruik voor decontaminatie dient een minimale contacttijd van 10 minuten te worden aangehouden.
Als alternatief kunnen commercieel verkrijgbare producten die gevalideerd zijn als DNA-vernietigende oppervlaktedecontaminanten worden gebruikt als de lokale veiligheidsaanbevelingen het gebruik van natriumhypochloriet niet toestaan of als natriumhypochloriet niet geschikt is voor het decontamineren van metalen onderdelen van apparatuur.
Idealiter zouden medewerkers zich moeten houden aan de ethos van een unidirectionele werkstroom en niet op dezelfde dag van vuile ruimtes (na de PCR) teruggaan naar schone ruimtes (vóór de PCR). Er kunnen zich echter situaties voordoen waarin dit onvermijdelijk is. In zo'n geval moet het personeel ervoor zorgen dat ze hun handen grondig wassen, handschoenen verwisselen, de daarvoor bestemde labjas dragen en geen apparatuur meenemen die ze later weer uit de ruimte willen halen, zoals labboeken. Dergelijke controlemaatregelen moeten worden benadrukt in de training van het personeel over moleculaire methoden.
Na gebruik moeten werktafels worden gereinigd met 10% natriumhypochloriet (gevolgd door steriel water om resten bleekmiddel te verwijderen), 70% ethanol of een gevalideerd, commercieel verkrijgbaar DNA-vernietigend decontaminant. Idealiter worden ultraviolette (UV) lampen gebruikt om decontaminatie door middel van bestraling mogelijk te maken. Het gebruik van UV-lampen dient echter te worden beperkt tot gesloten werkruimtes, zoals veiligheidskasten, om de blootstelling van het laboratoriumpersoneel aan UV-straling te beperken. Volg de instructies van de fabrikant voor het onderhoud, de ventilatie en de reiniging van UV-lampen om ervoor te zorgen dat de lampen effectief blijven.
Als u 70% ethanol gebruikt in plaats van natriumhypochloriet, is bestraling met UV-licht nodig om de decontaminatie te voltooien.
Reinig de vortex en centrifuge niet met natriumhypochloriet; veeg in plaats daarvan af met 70% ethanol en stel ze bloot aan UV-licht, of gebruik een commercieel DNA-vernietigend decontaminant. Raadpleeg bij morsen de fabrikant voor verder reinigingsadvies. Indien de instructies van de fabrikant dit toestaan, dienen pipetten routinematig te worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Als pipetten niet geschikt zijn voor de autoclaaf, volstaat het om ze te reinigen met 10% natriumhypochloriet (gevolgd door grondig afvegen met steriel water) of met een commercieel DNA-vernietigend decontaminant gevolgd door blootstelling aan UV-licht.
Reiniging met een hoog percentage natriumhypochloriet kan uiteindelijk schade toebrengen aan de kunststoffen en metalen van pipetten als dit regelmatig gebeurt; raadpleeg eerst de aanbevelingen van de fabrikant. Alle apparatuur moet regelmatig worden gekalibreerd volgens het door de fabrikant aanbevolen schema. Een aangewezen persoon moet ervoor zorgen dat het kalibratieschema wordt nageleefd, dat gedetailleerde logboeken worden bijgehouden en dat de servicelabels duidelijk op de apparatuur worden aangebracht.
3. Gebruiks- en reinigingsadvies voor de aangewezen moleculaire ruimte
Pre-PCR: Reagentia aliquoteren / mastermixbereiding: Dit moet de schoonste ruimte zijn die gebruikt wordt voor de voorbereiding van moleculaire experimenten en idealiter een daarvoor bestemde laminaire flowkast met een uv-lamp. Monsters, geëxtraheerd nucleïnezuur en geamplificeerde PCR-producten mogen in deze ruimte niet worden gehanteerd. Amplificatiereagentia moeten in een vriezer (of koelkast, volgens de aanbevelingen van de fabrikant) worden bewaard in dezelfde daarvoor bestemde ruimte, idealiter naast de laminaire flowkast of pre-PCR-ruimte. Handschoenen moeten elke keer worden vervangen bij het betreden van de pre-PCR-ruimte of laminaire flowkast.
De pre-PCR-ruimte of laminaire flowkast moet voor en na gebruik als volgt worden gereinigd: Veeg alle onderdelen in de kast, zoals pipetten, tipboxen, vortex, centrifuge, buisrekken, pennen, enz. af met 70% ethanol of een commercieel DNA-vernietigend decontaminant en laat ze drogen. In een gesloten werkruimte, zoals een laminaire flowkast, stelt u de kap 30 minuten bloot aan UV-licht.
Opmerking
Stel reagentia niet bloot aan UV-licht; plaats ze pas in de kast als deze schoon is. Bij het uitvoeren van reverse transcriptie-PCR kan het ook nuttig zijn om oppervlakken en apparatuur af te nemen met een oplossing die RNases bij contact afbreekt. Dit kan vals-negatieve resultaten door enzymafbraak van RNA helpen voorkomen. Na decontaminatie en vóór het bereiden van de mastermix moeten de handschoenen opnieuw worden vervangen, waarna de kast klaar is voor gebruik.
Pre-PCR: extractie van nucleïnezuur/toevoeging van templates:
Nucleïnezuur moet worden geëxtraheerd en verwerkt in een tweede aangewezen ruimte, met behulp van een aparte set pipetten, filtertips, buisrekken, schone handschoenen, labjassen en andere apparatuur. Deze ruimte is ook bedoeld voor het toevoegen van templates, controles en trendlijnen aan de mastermixbuizen of -platen. Om besmetting van de geëxtraheerde nucleïnezuurmonsters die worden geanalyseerd te voorkomen, wordt aanbevolen om handschoenen te verwisselen vóór het hanteren van positieve controles of standaarden en een aparte set pipetten te gebruiken. PCR-reagentia en geamplificeerde producten mogen niet in deze ruimte worden gepipetteerd. Monsters moeten worden bewaard in daarvoor bestemde koelkasten of vriezers in dezelfde ruimte. De monsterwerkruimte moet op dezelfde manier worden gereinigd als de mastermixruimte.
Post-PCR: Amplificatie en verwerking van het geamplificeerde product
Deze aangewezen ruimte is bestemd voor post-amplificatieprocessen en moet fysiek gescheiden zijn van de pre-PCR-ruimtes. Deze ruimte bevat doorgaans thermocyclers en realtime platforms, en idealiter een laminaire flowkast voor het toevoegen van het PCR-product van ronde 1 aan de reactie van ronde 2, indien geneste PCR wordt uitgevoerd. PCR-reagentia en geëxtraheerd nucleïnezuur mogen in deze ruimte niet worden gehanteerd, aangezien het risico op besmetting hoog is. Deze ruimte moet beschikken over een aparte set handschoenen, labjassen, platen- en buisrekken, pipetten, filtertips, bakken en andere apparatuur. Buisjes moeten vóór opening worden gecentrifugeerd. De monsterwerkruimte moet op dezelfde manier worden gereinigd als de mastermixruimte.
Post-PCR: productanalyse
Deze ruimte is bestemd voor productdetectieapparatuur, zoals gelelektroforesetanks, powerpacks, UV-transilluminator en het geldocumentatiesysteem. Deze ruimte dient te beschikken over aparte sets handschoenen, labjassen, platen- en buisrekken, pipetten, filtertips, bakken en andere apparatuur. Er mogen geen andere reagentia in deze ruimte worden gebracht, met uitzondering van laadkleurstof, moleculaire marker, agarosegel en buffercomponenten. De monsterwerkruimte dient op dezelfde manier te worden gereinigd als de mastermixruimte.
Belangrijke opmerking
Idealiter worden de pre-PCR-ruimtes niet op dezelfde dag betreden als er al werkzaamheden in de post-PCR-ruimtes zijn verricht. Indien dit absoluut noodzakelijk is, zorg er dan voor dat de handen eerst grondig worden gewassen en dat er specifieke labjassen in de ruimtes worden gedragen. Labboeken en -documenten mogen niet worden meegenomen naar de pre-PCR-ruimtes als ze in de post-PCR-ruimtes zijn gebruikt; neem indien nodig duplicaatprints van protocollen/monster-ID's, enz.
4. Algemeen advies over moleculaire biologie
Gebruik poedervrije handschoenen om assay-inhibitie te voorkomen. Een correcte pipetteertechniek is essentieel om contaminatie te verminderen. Onjuist pipetteren kan leiden tot spatten bij het doseren van vloeistoffen en het ontstaan van aerosolen. Goede tips voor correct pipetteren vindt u via de volgende links: Gilson-gids voor pipetteren, Anachem-pipetteertechniekvideo's, Centrifugeer buisjes vóór het openen en open ze voorzichtig om spatten te voorkomen. Sluit de buisjes direct na gebruik om te voorkomen dat er contaminanten in terechtkomen.
Bij het uitvoeren van meerdere reacties, bereid één mastermix met gemeenschappelijke reagentia (bijv. water, dNTP's, buffer, primers en enzym) om het aantal reagensoverdrachten te minimaliseren en de kans op contaminatie te verkleinen. Het is aan te raden de mastermix op ijs of een koud blok te bereiden. Het gebruik van een hotstart-enzym kan de productie van niet-specifieke producten helpen verminderen. Bescherm reagentia met fluorescerende probes tegen licht om degradatie te voorkomen.
5. Interne controles
Neem goed gekarakteriseerde, bevestigde positieve en negatieve controles op, samen met een niet-template controle in alle reacties, en een meerpunts getitreerde trendlijn voor kwantitatieve reacties. De positieve controle mag niet zo sterk zijn dat deze een besmettingsrisico vormt. Neem positieve en negatieve extractiecontroles op bij het uitvoeren van nucleïnezuurextractie.
Het is aan te raden om in elke ruimte duidelijke instructies te plaatsen, zodat gebruikers op de hoogte zijn van de gedragsregels. Diagnostische laboratoria die zeer lage DNA- of RNA-niveaus in klinische monsters detecteren, kunnen als extra beveiligingsmaatregel aparte luchtbehandelingssystemen gebruiken met een licht positieve luchtdruk in de pre-PCR-ruimtes en een licht negatieve luchtdruk in de post-PCR-ruimtes.
Ten slotte is het ontwikkelen van een kwaliteitsborgingsplan (QA) nuttig. Zo'n plan moet lijsten bevatten van de voorraad reagentia en werkvoorraden, regels voor het bewaren van kits en reagentia, rapportage van controleresultaten, trainingsprogramma's voor personeel, algoritmen voor probleemoplossing en indien nodig corrigerende maatregelen.
6. Bibliografie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Hoofdstuk 3: Het opzetten van een qPCR-laboratorium. Een leidraad voor het testen van recreatiewateren met behulp van USEPA qPCR-methode 1611. Lansing-Michigan State University.
Public Health England, NHS. Britse normen voor microbiologisch onderzoek: Goede laboratoriumpraktijken bij het uitvoeren van moleculaire amplificatie-onderzoeken. Kwaliteitsrichtlijnen. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Het opzetten van een PCR-laboratorium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Routineonderhoud van centrifuges: reiniging, onderhoud en desinfectie van centrifuges, rotoren en adapters (White paper nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Goede Klinische Laboratoriumpraktijk (GCLP) voor moleculair gebaseerde testen gebruikt in diagnostische laboratoria. In: Akyar I, redacteur. Breed spectrum van kwaliteitscontrole. Rijeka, Kroatië: Intech; 2011: 29–52.
Plaatsingstijd: 16-07-2020
