Sameindagreiningaraðferðir geta framleitt mikið magn af kjarnsýru með því að magna upp snefilmagn sem finnst í sýnum. Þó að þetta sé gagnlegt til að gera næma greiningu mögulega, þá skapar það einnig möguleika á mengun vegna dreifingar mögnunarúða í rannsóknarstofuumhverfinu. Við framkvæmd tilrauna er hægt að grípa til ráðstafana til að forðast mengun hvarfefna, rannsóknarstofubúnaðar og vinnurýmis, þar sem slík mengun getur valdið falskt jákvæðum (eða falskt neikvæðum) niðurstöðum.
Til að draga úr líkum á mengun skal alltaf fylgja góðum rannsóknarstofuháttum. Sérstaklega skal gæta varúðar varðandi eftirfarandi atriði:
1. Meðhöndlun hvarfefna
2. Skipulag vinnurýmis og búnaðar
3. Notkunar- og þrifleiðbeiningar fyrir tiltekið sameindarými
4. Almenn ráðgjöf um sameindalíffræði
5. Innra eftirlit
6. Heimildaskrá
1. Meðhöndlun hvarfefna
Skiljið hvarfefnisglös stuttlega áður en þau eru opnuð til að koma í veg fyrir myndun úða. Skiptið um hvarfefni til að forðast endurtekna frystingu og þíðingu og mengun frumstofnsins. Merkið og dagsetjið öll hvarfefnis- og viðbragðsglös greinilega og haldið skrá yfir lotunúmer og framleiðslulotunúmer hvarfefna sem notuð eru í öllum tilraunum. Pípettið öll hvarfefni og sýni með síuoddum. Áður en þau eru keypt er ráðlegt að staðfesta við framleiðandann að síuoddarnir passi við þá pípettu sem á að nota.
2. Skipulag vinnurýmis og búnaðar
Skipuleggja skal vinnurými þannig að vinnuflæðið fari í eina átt, frá hreinum svæðum (fyrir PCR) til óhreinna svæða (eftir PCR). Eftirfarandi almennar varúðarráðstafanir munu hjálpa til við að draga úr líkum á mengun. Hafið aðskilin herbergi, eða að minnsta kosti líkamlega aðskilin svæði, fyrir: undirbúning mastermix, útdrátt kjarnsýru og viðbót DNA sniðmáts, mögnun og meðhöndlun magnaðrar afurðar og greiningu afurðar, t.d. gel rafdrætti.
Í sumum tilfellum getur verið erfitt að hafa fjögur aðskilin herbergi. Mögulegur en síður æskilegur kostur er að framkvæma undirbúning masterblöndunnar í sérstöku rými, t.d. lagflæðisskáp. Ef um er að ræða innfellda PCR-mögnun ætti að undirbúa masterblönduna fyrir aðra umferð viðbragða á „hreinu“ svæðinu fyrir undirbúning masterblöndunnar, en ígræðsluna með aðal PCR-afurðinni ætti að fara fram í mögnunarherberginu og ef mögulegt er í sérstöku rými (t.d. lagflæðisskáp).
Hvert herbergi/svæði þarf sérstakt sett af greinilega merktum pípettum, síuoddum, rörstöngum, hvirflum, skilvindum (ef við á), pennum, almennum rannsóknarstofuhvarfefnum, rannsóknarstofusloppum og kassa af hönskum sem verða geymdir á viðkomandi vinnustöðvum. Þvo skal hendur og skipta um hanska og rannsóknarstofuslopp þegar farið er á milli tilgreindra svæða. Ekki skal færa hvarfefni og búnað frá óhreinu svæði yfir á hreint svæði. Ef upp koma öfgafullar aðstæður þar sem færa þarf hvarfefni eða búnað aftur á bak, verður fyrst að afmenga það með 10% natríumhýpóklóríti og síðan þurrka það af með sæfðu vatni.
Athugið
10% natríumhýpóklórítlausnin verður að vera útbúin fersk daglega. Þegar hún er notuð til afmengunar skal gæta þess að hún hafi að minnsta kosti 10 mínútna snertitíma.
Einnig er hægt að nota vörur sem eru fáanlegar í verslunum og hafa verið staðfestar sem DNA-eyðileggjandi yfirborðshreinsiefni ef staðbundnar öryggisleiðbeiningar leyfa ekki notkun natríumhýpóklóríts eða ef natríumhýpóklórít hentar ekki til að hreinsa málmhluta búnaðar.
Helst ætti starfsfólk að fylgja einstefnu vinnuflæðisreglum og ekki fara frá óhreinum svæðum (eftir PCR) aftur yfir á hrein svæði (fyrir PCR) sama dag. Hins vegar geta komið upp aðstæður þar sem þetta er óhjákvæmilegt. Þegar slíkar aðstæður koma upp verður starfsfólk að gæta þess að þvo hendur vandlega, skipta um hanska, nota tilgreindan rannsóknarstofuslopp og ekki koma með neinn búnað sem það vill taka út úr herberginu aftur, svo sem rannsóknarstofubækur. Slíkar eftirlitsráðstafanir ætti að leggja áherslu á í þjálfun starfsfólks á sameindafræðilegum aðferðum.
Eftir notkun skal þrífa vinnusvæði með 10% natríumhýpóklóríti (og síðan sótthreinsuðu vatni til að fjarlægja leifar af bleikiefni), 70% etanóli eða viðurkenndu afmengunarefni sem eyðileggur DNA og er fáanlegt í verslunum. Helst ætti að setja upp útfjólubláa (UV) lampa til að gera kleift að afmenga með geislun. Hins vegar ætti notkun útfjólublárra lampa að vera takmörkuð við lokuð vinnusvæði, t.d. öryggisskápa, til að takmarka útsetningu starfsfólks rannsóknarstofunnar fyrir útfjólubláum geislum. Vinsamlegast fylgið leiðbeiningum framleiðanda um umhirðu, loftræstingu og þrif á útfjólubláum lampa til að tryggja að lamparnir haldist virkir.
Ef notað er 70% etanól í stað natríumhýpóklóríts þarf að geisla með útfjólubláu ljósi til að ljúka afmenguninni.
Ekki þrífa hvirfilinn og skilvinduna með natríumhýpóklóríti; þurrkið þess í stað með 70% etanóli og látið það vera í útfjólubláu ljósi, eða notið hefðbundið afmengunarefni sem eyðir DNA. Ef leki kemur upp skal hafa samband við framleiðanda til að fá frekari ráðleggingar um þrif. Ef leiðbeiningar framleiðanda leyfa, ætti að sótthreinsa pípettur reglulega með sjálfsofnun. Ef ekki er hægt að sjálfsofna pípettur ætti að nægja að þrífa þær með 10% natríumhýpóklóríti (og síðan þurrka þær vandlega með sæfðu vatni) eða með hefðbundnu afmengunarefni sem eyðir DNA og síðan láta þær vera í útfjólubláu ljósi.
Þrif með háu hlutfalli natríumhýpóklóríts geta að lokum skemmt plast og málma í pípettum ef það er gert reglulega; athugið fyrst ráðleggingar framleiðanda. Öllum búnaði þarf að kvarða reglulega samkvæmt áætlun framleiðanda. Tilnefndur einstaklingur ætti að sjá til þess að kvörðunaráætluninni sé fylgt, nákvæmum skrám sé haldið og þjónustumerki séu greinilega sýnd á búnaðinum.
3. Notkunar- og þrifleiðbeiningar fyrir tiltekið sameindarými
For-PCR: Úthlutun hvarfefna / undirbúningur blöndu: Þetta ætti að vera hreinasta rýmið sem notað er til undirbúnings sameindatilrauna og ætti helst að vera tileinkað laminarflæðisskáp með útfjólubláu ljósi. Sýni, útdregna kjarnsýru og magnaðar PCR vörur má ekki meðhöndla á þessu svæði. Magnunarhvarfefni ættu að vera geymd í frysti (eða ísskáp, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda) á sama tiltekna rými, helst við hliðina á laminarflæðisskápnum eða for-PCR svæðinu. Skipta skal um hanska í hvert skipti sem komið er inn í for-PCR svæðið eða laminarflæðisskápinn.
For-PCR svæðið eða lagflæðisskápinn skal þrífa fyrir og eftir notkun á eftirfarandi hátt: Þurrkið af alla hluti í skápnum, t.d. pípettur, oddiskassa, vortex, skilvindu, rörrekki, penna o.s.frv. með 70% etanóli eða hefðbundnu afmengunarefni sem eyðileggur DNA og látið þorna. Ef um lokað vinnusvæði er að ræða, t.d. lagflæðisskáp, skal láta hettuna vera í útfjólubláu ljósi í 30 mínútur.
Athugið
Ekki láta hvarfefni verða fyrir útfjólubláu ljósi; færið þau aðeins inn í skápinn þegar hann er hreinn. Ef framkvæmt er öfug umritunar-PCR getur einnig verið gagnlegt að þurrka af yfirborð og búnað með lausn sem brýtur niður RNasa við snertingu. Þetta getur hjálpað til við að forðast falskt neikvæðar niðurstöður vegna niðurbrots ensíma á RNA. Eftir afmengun og áður en mastermixið er útbúið skal skipta um hanska aftur og þá er skápurinn tilbúinn til notkunar.
For-PCR: Útdráttur kjarnsýru/viðbót sniðmáts:
Kjarnsýru verður að draga út og meðhöndla á öðru tilteknu svæði með því að nota sérstakt sett af pípettum, síuoddum, rekki fyrir rör, nýja hanska, rannsóknarstofusloppum og öðrum búnaði. Þetta svæði er einnig til að bæta sniðmáti, samanburði og stefnulínum við mastermix-rörin eða -plöturnar. Til að forðast mengun á útdregnum kjarnsýrusýnum sem eru greind er mælt með því að skipta um hanska áður en jákvæð samanburður eða staðlar eru meðhöndlaðir og nota sérstakt sett af pípettum. PCR-hvarfefni og magnaðar vörur mega ekki vera pípettuð á þessu svæði. Sýni ættu að vera geymd í tilteknum kæli eða frysti á sama svæði. Vinnusvæðið fyrir sýnatöku ætti að vera hreinsað á sama hátt og mastermix-rýmið.
Eftir-PCR: Mögun og meðhöndlun magnaða afurðarinnar
Þetta rými er ætlað fyrir eftirmagnunarferli og ætti að vera aðskilið frá for-PCR svæðum. Það inniheldur venjulega hitahringrásartæki og rauntíma vettvanga og helst ætti það að hafa laminar flæðisskáp til að bæta PCR afurðinni úr 1. umferð við viðbrögðin úr 2. umferð, ef innfelld PCR er framkvæmd. Ekki má meðhöndla PCR hvarfefni og útdregna kjarnsýru á þessu svæði þar sem hætta á mengun er mikil. Þetta svæði ætti að hafa aðskilið sett af hönskum, rannsóknarstofusloppum, plötu- og rörrekkjum, pípettum, síuoddum, ílátum og öðrum búnaði. Rör verða að vera skilvindaðar áður en þær eru opnaðar. Sýnishornssvæðið ætti að vera hreinsað á sama hátt og rýmið fyrir aðalblöndun.
Eftir-PCR: Vörugreining
Þetta herbergi er fyrir búnað til að greina afurðir, t.d. rafgreiningartanka fyrir gel, aflgjafa, útfjólubláa ljósgjafa og skjalakerfi fyrir gel. Þetta svæði ætti að hafa aðskilin sett af hönskum, rannsóknarstofusloppum, plötu- og rörrekkjum, pípettum, síuoddum, ílátum og öðrum búnaði. Ekki má koma með önnur hvarfefni inn á þetta svæði, að undanskildum litarefnum, sameindamerkjum og agarósageli, og stuðpúðahlutum. Sýnasvæðinu skal þrífa á sama hátt og rýmið fyrir aðalblöndun.
Mikilvæg athugasemd
Helst ætti ekki að fara inn í for-PCR herbergin sama dag og vinna hefur þegar farið fram í eftir-PCR herbergjunum. Ef þetta er algjörlega óhjákvæmilegt skal tryggja að hendur séu fyrst þvegnar vandlega og að sérstök rannsóknarstofusloppar séu notaðir í herbergjunum. Ekki má taka rannsóknarstofubækur og skjöl með inn í for-PCR herbergin ef þau hafa verið notuð í eftir-PCR herbergjunum; ef nauðsyn krefur skal taka afrit af samskiptareglum/sýnakennum o.s.frv.
4. Almenn ráðgjöf um sameindalíffræði
Notið púðurlausa hanska til að forðast hömlun á prófuninni. Rétt pípettunaraðferð er afar mikilvæg til að draga úr mengun. Röng pípettunaraðferð getur leitt til skvetta við dreifingu vökva og myndunar úða. Góðar venjur við rétta pípettunaraðferð er að finna á eftirfarandi tenglum: Gilson handbók um pípettunaraðferðir, Anachem pípettunaraðferðir myndbönd, Skilvinduglös fyrir opnun og opnið þau varlega til að forðast skvettur. Lokið glösunum strax eftir notkun til að koma í veg fyrir að mengunarefni komist inn í þau.
Þegar margar efnahvarfa eru framkvæmdar skal útbúa eina masterblöndu sem inniheldur sameiginleg hvarfefni (t.d. vatn, dNTP, stuðpúða, praimera og ensím) til að lágmarka fjölda hvarfefnaflutninga og draga úr mengunarhættu. Mælt er með að setja masterblönduna á ís eða kaldan blokk. Notkun heitstartensíms getur hjálpað til við að draga úr framleiðslu ósértækra afurða. Verjið hvarfefni sem innihalda flúrljómandi rannsakendur gegn ljósi til að koma í veg fyrir niðurbrot.
5. Innra eftirlit
Hafið með vel greindar, staðfestar jákvæðar og neikvæðar samanburðaraðferðir, ásamt samanburði án sniðmáts í öllum viðbrögðum og fjölpunkta títraða stefnulínu fyrir megindlega viðbrögð. Jákvæða samanburðurinn ætti ekki að vera svo sterkur að hann valdi mengunarhættu. Hafið með jákvæðar og neikvæðar útdráttaraðferðir þegar kjarnsýruútdráttur er framkvæmdur.
Mælt er með að skýrar leiðbeiningar séu settar upp á hverju svæði svo að notendur séu meðvitaðir um hegðunarreglurnar. Greiningarstofur sem greina mjög lágt magn DNA eða RNA í klínískum sýnum gætu viljað grípa til viðbótaröryggisráðstafana með því að hafa aðskilin loftræstikerfi með örlítið jákvæðum loftþrýstingi í herbergjunum fyrir PCR og örlítið neikvæðum loftþrýstingi í herbergjunum eftir PCR.
Að lokum er gagnlegt að þróa gæðaáætlun. Slík áætlun ætti að innihalda lista yfir hvarfefnisbirgðir og vinnslubirgðir, reglur um geymslu á pökkum og hvarfefnum, skýrslugjöf um niðurstöður eftirlits, þjálfunaráætlanir starfsfólks, reiknirit til bilanaleitar og úrbótaaðgerðir ef þörf krefur.
6. Heimildaskrá
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. kafli: Uppsetning qPCR rannsóknarstofu. Leiðbeiningarskjal um prófanir á afþreyingarvötnum með USEPA qPCR aðferð 1611. Lansing-Michigan State University.
Lýðheilsustofnun Englands, NHS. Staðlar í Bretlandi fyrir örverufræðilegar rannsóknir: Góð rannsóknarstofuvenja við framkvæmd sameindamagnunarprófa. Gæðaleiðbeiningar. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Uppsetning á PCR rannsóknarstofu. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Reglulegt viðhald skilvindu: þrif, viðhald og sótthreinsun skilvindu, snúningsása og millistykki (Hvítbók nr. 14). Hamborg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Góð klínísk rannsóknarstofuháttur (GCLP) fyrir sameindapróf sem notuð eru í greiningarstofum. Í: Akyar I, ritstjóri. Breitt svið gæðaeftirlits. Rijeka, Króatía: Intech; 2011: 29–52.
Birtingartími: 16. júlí 2020
