आणविक परीक्षण के लिए क्या करें और क्या न करें

आणविक संसूचन विधियों में नमूनों में पाए जाने वाले सूक्ष्म अंशों के प्रवर्धन द्वारा न्यूक्लिक अम्ल की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने की क्षमता होती है। यद्यपि यह संवेदनशील संसूचन को सक्षम करने के लिए लाभदायक है, लेकिन यह प्रयोगशाला वातावरण में प्रवर्धन एरोसोल के प्रसार के माध्यम से संदूषण की संभावना भी उत्पन्न करता है। प्रयोग करते समय, अभिकर्मकों, प्रयोगशाला उपकरणों और बेंच स्थान के संदूषण से बचने के उपाय किए जा सकते हैं, क्योंकि ऐसा संदूषण गलत-सकारात्मक (या गलत-नकारात्मक) परिणाम उत्पन्न कर सकता है।

संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, हर समय अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास का पालन किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, निम्नलिखित बिंदुओं पर सावधानी बरती जानी चाहिए:

1. अभिकर्मकों को संभालना
2. कार्यस्थल और उपकरणों का संगठन
3. निर्दिष्ट आणविक स्थान के लिए उपयोग और सफाई संबंधी सलाह
4. सामान्य आणविक जीव विज्ञान सलाह
5. आंतरिक नियंत्रण
6. ग्रंथ सूची

1. अभिकर्मकों को संभालना

एरोसोल बनने से बचने के लिए, अभिकर्मक नलिकाओं को खोलने से पहले उन्हें थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। बार-बार जमने-पिघलने और मास्टर स्टॉक के संदूषण से बचने के लिए अभिकर्मकों को अलग-अलग भागों में बाँटें। सभी अभिकर्मकों और अभिक्रिया नलिकाओं पर स्पष्ट रूप से लेबल और दिनांक लगाएँ और सभी प्रयोगों में प्रयुक्त अभिकर्मक लॉट और बैच संख्याओं का लॉग रखें। फ़िल्टर टिप का उपयोग करके सभी अभिकर्मकों और नमूनों को पिपेट से भरें। खरीदने से पहले, निर्माता से यह पुष्टि कर लेना उचित है कि फ़िल्टर टिप इस्तेमाल किए जाने वाले पिपेट के ब्रांड के लिए उपयुक्त हैं।

2. कार्यस्थल और उपकरणों का संगठन

कार्यस्थल को इस तरह व्यवस्थित किया जाना चाहिए कि कार्य का प्रवाह एक ही दिशा में हो, साफ़ क्षेत्रों (पीसीआर-पूर्व) से गंदे क्षेत्रों (पीसीआर-पश्चात) तक। निम्नलिखित सामान्य सावधानियाँ संदूषण की संभावना को कम करने में मदद करेंगी। मास्टरमिक्स तैयार करने, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और डीएनए टेम्प्लेट जोड़ने, प्रवर्धन और प्रवर्धित उत्पाद की हैंडलिंग, और उत्पाद विश्लेषण, जैसे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, के लिए अलग-अलग निर्दिष्ट कमरे, या कम से कम भौतिक रूप से अलग क्षेत्र रखें।

कुछ स्थितियों में, 4 अलग-अलग कमरे रखना मुश्किल होता है। एक संभावित लेकिन कम वांछनीय विकल्प यह है कि मास्टरमिक्स की तैयारी किसी नियंत्रण क्षेत्र, जैसे कि लैमिनार फ्लो कैबिनेट, में की जाए। नेस्टेड पीसीआर एम्प्लीफिकेशन के मामले में, दूसरे दौर की प्रतिक्रिया के लिए मास्टरमिक्स की तैयारी मास्टरमिक्स तैयारी के लिए 'स्वच्छ' क्षेत्र में की जानी चाहिए, लेकिन प्राथमिक पीसीआर उत्पाद का टीकाकरण प्रवर्धन कक्ष में, और यदि संभव हो तो एक समर्पित नियंत्रण क्षेत्र (जैसे कि लैमिनार फ्लो कैबिनेट) में किया जाना चाहिए।

प्रत्येक कमरे/क्षेत्र के लिए स्पष्ट रूप से चिह्नित पिपेट, फ़िल्टर टिप, ट्यूब रैक, वोर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज (यदि आवश्यक हो), पेन, सामान्य लैब अभिकर्मक, लैब कोट और दस्तानों के बक्सों का एक अलग सेट आवश्यक है जो अपने-अपने कार्यस्थल पर ही रहेंगे। निर्दिष्ट क्षेत्रों के बीच जाते समय हाथ धोने होंगे और दस्तानों व लैब कोट बदलने होंगे। अभिकर्मकों और उपकरणों को गंदे क्षेत्र से साफ़ क्षेत्र में नहीं ले जाना चाहिए। यदि कोई गंभीर स्थिति उत्पन्न हो जहाँ किसी अभिकर्मक या उपकरण को पीछे की ओर ले जाना पड़े, तो पहले उसे 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट से कीटाणुरहित करना होगा, उसके बाद जीवाणुरहित पानी से पोंछना होगा।

टिप्पणी

10% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल रोज़ाना ताज़ा बनाया जाना चाहिए। संदूषण-शोधन के लिए इस्तेमाल करते समय, कम से कम 10 मिनट का संपर्क समय बनाए रखना चाहिए।
वैकल्पिक रूप से, यदि स्थानीय सुरक्षा अनुशंसाएं सोडियम हाइपोक्लोराइट के उपयोग की अनुमति नहीं देती हैं या यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट उपकरणों के धातु भागों को संदूषित करने के लिए उपयुक्त नहीं है, तो डीएनए को नष्ट करने वाले सतह संदूषित करने वाले के रूप में मान्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों का उपयोग किया जा सकता है।

आदर्श रूप से, कर्मचारियों को एकदिशीय कार्यप्रवाह की नीति का पालन करना चाहिए और उसी दिन गंदे क्षेत्रों (पीसीआर के बाद) से साफ़ क्षेत्रों (पीसीआर से पहले) में वापस नहीं जाना चाहिए। हालाँकि, ऐसे अवसर आ सकते हैं जब यह अपरिहार्य हो। जब ऐसा अवसर आए, तो कर्मचारियों को ध्यान रखना चाहिए कि वे अच्छी तरह से हाथ धोएँ, दस्ताने बदलें, निर्धारित लैब कोट पहनें और कोई भी ऐसा उपकरण न लाएँ जिसे वे दोबारा कमरे से बाहर ले जाना चाहें, जैसे कि लैब की किताबें। आणविक विधियों पर कर्मचारियों के प्रशिक्षण में ऐसे नियंत्रण उपायों पर ज़ोर दिया जाना चाहिए।

उपयोग के बाद, बेंचों को 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट (अवशिष्ट ब्लीच हटाने के लिए स्टेराइल पानी से धोना चाहिए), 70% इथेनॉल, या किसी प्रमाणित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए-विनाशक परिशोधक से साफ़ किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, विकिरण द्वारा परिशोधन के लिए पराबैंगनी (यूवी) लैंप लगाए जाने चाहिए। हालाँकि, प्रयोगशाला कर्मचारियों के यूवी जोखिम को सीमित करने के लिए यूवी लैंप का उपयोग बंद कार्य क्षेत्रों, जैसे सुरक्षा अलमारियाँ, तक ही सीमित रखा जाना चाहिए। लैंप की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए, कृपया यूवी लैंप की देखभाल, वेंटिलेशन और सफाई के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

यदि सोडियम हाइपोक्लोराइट के स्थान पर 70% इथेनॉल का उपयोग किया जाए, तो संदूषण को पूरा करने के लिए यूवी प्रकाश से विकिरण की आवश्यकता होगी।
भंवर और सेंट्रीफ्यूज को सोडियम हाइपोक्लोराइट से साफ़ न करें; इसके बजाय, 70% इथेनॉल से पोंछकर यूवी प्रकाश में रखें, या किसी व्यावसायिक डीएनए-विनाशक परिशोधक का उपयोग करें। रिसाव के लिए, आगे की सफ़ाई सलाह के लिए निर्माता से संपर्क करें। यदि निर्माता के निर्देश अनुमति देते हैं, तो पिपेट को नियमित रूप से आटोक्लेव द्वारा जीवाणुरहित किया जाना चाहिए। यदि पिपेट को आटोक्लेव नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट से साफ़ करना (इसके बाद जीवाणुरहित पानी से अच्छी तरह पोंछना) या किसी व्यावसायिक डीएनए-विनाशक परिशोधक से साफ़ करके यूवी प्रकाश में रखना पर्याप्त होगा।

यदि नियमित रूप से उच्च-प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइट से सफाई की जाए, तो अंततः पिपेट प्लास्टिक और धातुओं को नुकसान पहुँच सकता है; पहले निर्माता की सिफारिशों की जाँच कर लें। सभी उपकरणों को निर्माता द्वारा सुझाए गए शेड्यूल के अनुसार नियमित रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। एक निर्दिष्ट व्यक्ति को यह सुनिश्चित करने का प्रभारी होना चाहिए कि कैलिब्रेशन शेड्यूल का पालन किया जाए, विस्तृत लॉग बनाए रखे जाएँ, और उपकरणों पर सर्विस लेबल स्पष्ट रूप से प्रदर्शित हों।

3. निर्दिष्ट आणविक स्थान के लिए उपयोग और सफाई संबंधी सलाह

प्री-पीसीआर: अभिकर्मक विभाजक/मास्टरमिक्स तैयारी: यह आणविक प्रयोगों की तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी स्थानों में सबसे साफ़ होना चाहिए और आदर्श रूप से एक निर्दिष्ट लेमिनार फ्लो कैबिनेट होना चाहिए जो यूवी प्रकाश से सुसज्जित हो। नमूने, निकाले गए न्यूक्लिक अम्ल और प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों को इस क्षेत्र में नहीं रखा जाना चाहिए। प्रवर्धन अभिकर्मकों को उसी निर्दिष्ट स्थान पर, आदर्श रूप से लेमिनार फ्लो कैबिनेट या प्री-पीसीआर क्षेत्र के बगल में, एक फ्रीजर (या निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, रेफ्रिजरेटर) में रखा जाना चाहिए। प्री-पीसीआर क्षेत्र या लेमिनार फ्लो कैबिनेट में प्रवेश करने पर हर बार दस्ताने बदलने चाहिए।

प्री-पीसीआर क्षेत्र या लेमिनार फ्लो कैबिनेट को इस्तेमाल से पहले और बाद में इस प्रकार साफ़ किया जाना चाहिए: कैबिनेट में मौजूद सभी वस्तुओं, जैसे पिपेट, टिप बॉक्स, वोर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज, ट्यूब रैक, पेन आदि को 70% इथेनॉल या किसी व्यावसायिक डीएनए-विनाशक डिकॉन्टैमिनेंट से पोंछकर सूखने दें। बंद कार्य क्षेत्र, जैसे लेमिनार फ्लो कैबिनेट, के मामले में, हुड को 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश में रखें।

टिप्पणी

अभिकर्मकों को यूवी प्रकाश में न रखें; उन्हें कैबिनेट में तभी रखें जब वह साफ़ हो जाए। यदि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर कर रहे हैं, तो सतहों और उपकरणों को ऐसे घोल से पोंछना भी मददगार हो सकता है जो संपर्क में आने पर आरएनएज़ को तोड़ देता है। इससे आरएनए के एंजाइम क्षरण से होने वाले झूठे-नकारात्मक परिणामों से बचने में मदद मिल सकती है। विसंक्रमण के बाद और मास्टरमिक्स तैयार करने से पहले, दस्ताने एक बार फिर बदल देने चाहिए, और फिर कैबिनेट उपयोग के लिए तैयार है।

प्री-पीसीआर: न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण/टेम्पलेट जोड़:

न्यूक्लिक अम्ल को एक दूसरे निर्दिष्ट क्षेत्र में निकाला और संभाला जाना चाहिए, जहाँ पिपेट, फ़िल्टर टिप, ट्यूब रैक, नए दस्ताने, लैब कोट और अन्य उपकरणों का एक अलग सेट इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह क्षेत्र मास्टरमिक्स ट्यूब या प्लेटों में टेम्पलेट, नियंत्रण और ट्रेंडलाइन जोड़ने के लिए भी है। विश्लेषण किए जा रहे निकाले गए न्यूक्लिक अम्ल नमूनों को दूषित होने से बचाने के लिए, सकारात्मक नियंत्रण या मानक नमूनों को संभालने से पहले दस्ताने बदलने और पिपेट के एक अलग सेट का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। पीसीआर अभिकर्मकों और प्रवर्धित उत्पादों को इस क्षेत्र में पिपेट नहीं किया जाना चाहिए। नमूनों को उसी क्षेत्र में निर्दिष्ट रेफ्रिजरेटर या फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए। नमूना कार्यस्थान को मास्टरमिक्स स्थान की तरह ही साफ़ किया जाना चाहिए।

पोस्ट-पीसीआर: प्रवर्धित उत्पाद का प्रवर्धन और संचालन

यह निर्दिष्ट स्थान प्रवर्धन-पश्चात प्रक्रियाओं के लिए है और इसे पूर्व-पीसीआर क्षेत्रों से भौतिक रूप से अलग होना चाहिए। इसमें आमतौर पर थर्मोसाइक्लर और रीयल-टाइम प्लेटफ़ॉर्म होते हैं, और आदर्श रूप से, यदि नेस्टेड पीसीआर किया जा रहा है, तो राउंड 1 पीसीआर उत्पाद को राउंड 2 अभिक्रिया में जोड़ने के लिए एक लैमिनार फ्लो कैबिनेट होना चाहिए। पीसीआर अभिकर्मकों और निकाले गए न्यूक्लिक एसिड को इस क्षेत्र में नहीं रखा जाना चाहिए क्योंकि संदूषण का जोखिम अधिक होता है। इस क्षेत्र में दस्ताने, लैब कोट, प्लेट और ट्यूब रैक, पिपेट, फ़िल्टर टिप, डिब्बे और अन्य उपकरणों का एक अलग सेट होना चाहिए। खोलने से पहले ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए। नमूना कार्यस्थान को मास्टरमिक्स स्थान की तरह ही साफ़ किया जाना चाहिए।

पोस्ट-पीसीआर: उत्पाद विश्लेषण

यह कमरा उत्पाद पहचान उपकरणों के लिए है, जैसे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक, पावर पैक, यूवी ट्रांसइल्यूमिनेटर और जेल डॉक्यूमेंटेशन सिस्टम। इस क्षेत्र में दस्ताने, लैब कोट, प्लेट और ट्यूब रैक, पिपेट, फ़िल्टर टिप्स, डिब्बे और अन्य उपकरणों के अलग-अलग सेट होने चाहिए। लोडिंग डाई, मॉलिक्यूलर मार्कर और एगरोज़ जेल, और बफर घटकों को छोड़कर, इस क्षेत्र में कोई अन्य अभिकर्मक नहीं लाया जा सकता। नमूना कार्य क्षेत्र को मास्टरमिक्स स्थान की तरह ही साफ़ किया जाना चाहिए।

महत्वपूर्ण नोट

आदर्श रूप से, यदि पोस्ट-पीसीआर कक्षों में पहले ही काम हो चुका है, तो उसी दिन प्री-पीसीआर कक्षों में प्रवेश नहीं करना चाहिए। यदि यह पूरी तरह से अपरिहार्य है, तो सुनिश्चित करें कि पहले हाथ अच्छी तरह धोए जाएँ और कमरों में विशिष्ट लैब कोट पहने जाएँ। यदि लैब की किताबें और कागज़ात पोस्ट-पीसीआर कक्षों में इस्तेमाल किए गए हैं, तो उन्हें प्री-पीसीआर कक्षों में नहीं ले जाना चाहिए; यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल/सैंपल आईडी आदि के डुप्लिकेट प्रिंटआउट ले लें।

4. सामान्य आणविक जीव विज्ञान सलाह

परख में रुकावट से बचने के लिए पाउडर-रहित दस्तानों का इस्तेमाल करें। संदूषण को कम करने के लिए सही पाइपिंग तकनीक बेहद ज़रूरी है। गलत पाइपिंग के कारण तरल पदार्थ निकालते समय छींटे पड़ सकते हैं और एरोसोल बन सकते हैं। सही पाइपिंग के लिए अच्छे तरीके निम्नलिखित लिंक पर देखे जा सकते हैं: गिलसन गाइड टू पाइपिंग, एनाकेम पाइपिंग तकनीक वीडियो, खोलने से पहले ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, और छींटे पड़ने से बचने के लिए उन्हें सावधानी से खोलें। संदूषकों के प्रवेश से बचने के लिए इस्तेमाल के तुरंत बाद ट्यूबों को बंद कर दें।

एकाधिक अभिक्रियाएँ करते समय, अभिकर्मकों के स्थानांतरण की संख्या न्यूनतम रखने और संदूषण के खतरे को कम करने के लिए, सामान्य अभिकर्मकों (जैसे जल, dNTPs, बफर, प्राइमर और एंजाइम) से युक्त एक मास्टरमिक्स तैयार करें। मास्टरमिक्स को बर्फ या ठंडे ब्लॉक पर रखने की सलाह दी जाती है। हॉट स्टार्ट एंजाइम का उपयोग गैर-विशिष्ट उत्पादों के उत्पादन को कम करने में मदद कर सकता है। क्षय से बचने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोब युक्त अभिकर्मकों को प्रकाश से बचाएँ।

5. आंतरिक नियंत्रण

सभी अभिक्रियाओं में सुस्पष्ट, पुष्ट धनात्मक और ऋणात्मक नियंत्रणों के साथ-साथ एक नो-टेम्पलेट नियंत्रण, और मात्रात्मक अभिक्रियाओं के लिए एक बहु-बिंदु अनुमापित प्रवृत्ति रेखा शामिल करें। धनात्मक नियंत्रण इतना प्रबल नहीं होना चाहिए कि उससे संदूषण का जोखिम उत्पन्न हो। न्यूक्लिक अम्ल निष्कर्षण करते समय धनात्मक और ऋणात्मक निष्कर्षण नियंत्रणों को शामिल करें।

यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक क्षेत्र में स्पष्ट निर्देश लगाए जाएँ ताकि उपयोगकर्ता आचरण के नियमों से अवगत हों। नैदानिक ​​नमूनों में डीएनए या आरएनए के बहुत कम स्तर का पता लगाने वाली नैदानिक ​​प्रयोगशालाएँ अतिरिक्त सुरक्षा उपाय अपना सकती हैं, जैसे कि प्री-पीसीआर कक्षों में थोड़ा धनात्मक वायुदाब और पोस्ट-पीसीआर कक्षों में थोड़ा ऋणात्मक वायुदाब वाली अलग-अलग वायु संचालन प्रणालियाँ।

अंत में, एक गुणवत्ता आश्वासन (QA) योजना विकसित करना उपयोगी होगा। ऐसी योजना में अभिकर्मक मास्टर स्टॉक और कार्यशील स्टॉक की सूची, किट और अभिकर्मकों के भंडारण के नियम, नियंत्रण परिणामों की रिपोर्टिंग, कर्मचारियों के प्रशिक्षण कार्यक्रम, समस्या निवारण एल्गोरिदम और ज़रूरत पड़ने पर सुधारात्मक कार्रवाई शामिल होनी चाहिए।

6. ग्रंथ सूची

असलान ए, किन्ज़ेलमैन जे, ड्रीलिन ई, अनानेवा टी, लैवेंडर जे. अध्याय 3: एक क्यूपीसीआर प्रयोगशाला की स्थापना। यूएसईपीए क्यूपीसीआर विधि 1611 का उपयोग करके मनोरंजक जल परीक्षण के लिए एक मार्गदर्शन दस्तावेज़। लैंसिंग-मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी।

पब्लिक हेल्थ इंग्लैंड, एनएचएस। माइक्रोबायोलॉजी जांच के लिए यूके मानक: आणविक प्रवर्धन परख करते समय अच्छी प्रयोगशाला पद्धति। गुणवत्ता मार्गदर्शन। 2013;4(4):1–15।

मिफ्लिन टी. पीसीआर प्रयोगशाला की स्थापना। कोल्ड स्प्रिंग हार्ब प्रोटोकॉल। 2007;7.

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