Molekyylitason detektiomenetelmillä voidaan tuottaa suuria määriä nukleiinihappoja monistamalla näytteissä olevia pieniä määriä nukleiinihappoja. Vaikka tämä on hyödyllistä herkän havaitsemisen kannalta, se tuo mukanaan myös kontaminaatioriskin monistusaerosolien leviämisen kautta laboratorioympäristössä. Kokeita suoritettaessa voidaan ryhtyä toimenpiteisiin reagenssien, laboratoriolaitteiden ja työtilan kontaminaation välttämiseksi, sillä tällainen kontaminaatio voi aiheuttaa vääriä positiivisia (tai vääriä negatiivisia) tuloksia.
Kontaminaation todennäköisyyden vähentämiseksi on noudatettava hyvää laboratoriokäytäntöä kaikkina aikoina. Erityisesti seuraaviin seikkoihin on kiinnitettävä huomiota:
1. Reagenssien käsittely
2. Työtilan ja laitteiden organisointi
3. Käyttö- ja puhdistusohjeet kyseiselle molekyylitilalle
4. Yleisiä molekyylibiologian ohjeita
5. Sisäinen valvonta
6. Lähdeluettelo
1. Reagenssien käsittely
Sentrifugoi reagenssiputket lyhyesti ennen avaamista aerosolien muodostumisen välttämiseksi. Jaa reagenssit erihin useiden pakastus-sulatusten ja peruskantojen kontaminaation välttämiseksi. Merkitse ja päivää kaikki reagenssi- ja reaktioputket selkeästi ja pidä kirjaa kaikissa kokeissa käytetyistä reagenssien eristä ja tuotenumeroista. Pipetoi kaikki reagenssit ja näytteet suodatinkärkien avulla. Ennen ostamista on suositeltavaa varmistaa valmistajalta, että suodatinkärjet sopivat käytettävään pipettimerkkiin.
2. Työtilan ja laitteiden organisointi
Työtila tulee järjestää siten, että työvirta tapahtuu yhteen suuntaan, puhtailta alueilta (ennen PCR:ää) likaisille alueille (PCR:n jälkeen). Seuraavat yleiset varotoimet auttavat vähentämään kontaminaatioriskiä. Käytä erillisiä nimettyjä huoneita tai vähintään fyysisesti erillisiä alueita seuraaville: mastermixin valmistus, nukleiinihappojen eristys ja DNA-templaatin lisäys, monistus ja monistetun tuotteen käsittely sekä tuoteanalyysi, esim. geelielektroforeesi.
Joissakin olosuhteissa neljän erillisen huoneen pitäminen on vaikeaa. Mahdollinen, mutta vähemmän toivottava vaihtoehto on tehdä mastermixin valmistus suojatilassa, esimerkiksi laminaarivirtauskaapissa. Sisäkkäisen PCR-monistusmenetelmän tapauksessa toisen kierroksen reaktion mastermix tulisi valmistaa mastermixin valmistuksen "puhtaassa" tilassa, mutta primaarisen PCR-tuotteen inokulointi tulisi tehdä monistushuoneessa ja mahdollisuuksien mukaan erillisessä suojatilassa (esim. laminaarivirtauskaapissa).
Jokaisella huoneella/alueella on oltava erillinen selkeästi merkityt pipetit, suodatinkärjet, koeputkitelineet, vortex-laitteet, sentrifugit (tarvittaessa), kynät, yleiset laboratorioreagenssit, laboratoriotakit ja käsinelaatikot, jotka säilytetään omilla työasemilla. Kädet on pestävä ja käsineet ja laboratoriotakit vaihdettava siirryttäessä nimettyjen alueiden välillä. Reagensseja ja laitteita ei saa siirtää likaiselta alueelta puhtaalle alueelle. Äärimmäisissä tapauksissa, joissa reagenssi tai laite on siirrettävä taaksepäin, se on ensin dekontaminoitava 10-prosenttisella natriumhypokloriittiliuoksella ja pyyhittävä sen jälkeen steriilillä vedellä.
Huomautus
10-prosenttinen natriumhypokloriittiliuos on valmistettava päivittäin. Dekontaminaatioon käytettäessä on noudatettava vähintään 10 minuutin kontaktiajan noudattamista.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia tuotteita, jotka on validoitu DNA:ta tuhoaviksi pintojen puhdistusaineiksi, jos paikalliset turvallisuussuositukset eivät salli natriumhypokloriitin käyttöä tai jos natriumhypokloriitti ei sovellu laitteiden metallisten osien puhdistamiseen.
Ihannetapauksessa henkilökunnan tulisi noudattaa yksisuuntaista työnkulkua eikä siirtyä likaisilta alueilta (PCR:n jälkeen) takaisin puhtaille alueille (PCR:ää ennen) samana päivänä. Saattaa kuitenkin olla tilanteita, joissa tämä on väistämätöntä. Tällaisessa tilanteessa henkilökunnan on pestävä kädet huolellisesti, vaihdettava käsineet, käytettävä laboratoriotakkia eikä tuotava mukaan laitteita, kuten laboratoriokirjoja, jotka he haluavat viedä takaisin huoneesta. Tällaisia valvontatoimenpiteitä tulisi korostaa henkilöstön molekyylimenetelmien koulutuksessa.
Käytön jälkeen työtilat tulee puhdistaa 10-prosenttisella natriumhypokloriittiliuoksella (jonka jälkeen steriilillä vedellä valkaisuaineen jäämien poistamiseksi), 70-prosenttisella etanolilla tai validoidulla kaupallisesti saatavilla olevalla DNA:ta tuhoavalla puhdistusaineella. Ihannetapauksessa tulisi asentaa ultraviolettilamput (UV-lamput), jotka mahdollistavat dekontaminaation säteilyttämällä. UV-lamppujen käyttö tulisi kuitenkin rajoittaa suljetuille työskentelyalueille, kuten suojakaapeille, laboratoriohenkilökunnan UV-altistuksen rajoittamiseksi. Noudata UV-lamppujen valmistajan ohjeita lamppujen hoidosta, ilmanvaihdosta ja puhdistuksesta, jotta lamput pysyvät tehokkaina.
Jos natriumhypokloriitin sijaan käytetään 70-prosenttista etanolia, puhdistuksen loppuun saattamiseksi tarvitaan UV-säteilytys.
Älä puhdista vortex-laitetta ja sentrifugia natriumhypokloriittilla; pyyhi sen sijaan 70-prosenttisella etanolilla ja altista UV-valolle tai käytä kaupallista DNA:ta tuhoavaa puhdistusainetta. Jos ainetta roiskuu, tarkista valmistajalta lisäohjeita puhdistuksesta. Jos valmistajan ohjeet sen sallivat, pipetit tulee steriloida rutiininomaisesti autoklaavilla. Jos pipettejä ei voida autoklavoida, riittää, että ne puhdistetaan 10-prosenttisella natriumhypokloriittiliuoksella (jonka jälkeen pyyhitään perusteellisesti steriilillä vedellä) tai kaupallisella DNA:ta tuhoavalla puhdistusaineella ja altistetaan UV-valolle.
Korkean natriumhypokloriittipitoisuuden omaavalla liuoksella puhdistaminen voi lopulta vahingoittaa pipettien muoveja ja metalleja, jos sitä tehdään säännöllisesti. Tarkista ensin valmistajan suositukset. Kaikki laitteet on kalibroitava säännöllisesti valmistajan suositteleman aikataulun mukaisesti. Nimetyn henkilön on oltava vastuussa kalibrointiaikataulun noudattamisesta, yksityiskohtaisten lokien pitämisestä ja huoltotarrojen selkeästä näkyvyydestä laitteissa.
3. Käyttö- ja puhdistusohjeet kyseiselle molekyylitilalle
Pre-PCR: Reagenssien jakelu / mastermixivalmistelu: Tämän tulisi olla puhtain kaikista molekyylikokeiden valmisteluun käytetyistä tiloista, ja sen tulisi mieluiten olla laminaarivirtauskaappi, jossa on UV-valo. Näytteitä, uutettuja nukleiinihappoja ja monistettuja PCR-tuotteita ei saa käsitellä tällä alueella. Monistusreagenssit tulee säilyttää pakastimessa (tai jääkaapissa valmistajan suositusten mukaisesti) samassa nimetyssä tilassa, mieluiten laminaarivirtauskaapin tai pre-PCR-alueen vieressä. Käsineet tulee vaihtaa aina pre-PCR-alueelle tai laminaarivirtauskaappiin mentäessä.
PCR-vaihetta edeltävä alue tai laminaarivirtauskaappi on puhdistettava ennen käyttöä ja käytön jälkeen seuraavasti: Pyyhi kaikki kaapissa olevat esineet, esim. pipetit, kärkilaatikot, vortex-sekoitin, sentrifugi, putkitelineet, kynät jne. 70-prosenttisella etanolilla tai kaupallisella DNA:ta tuhoavalla puhdistusaineella ja anna niiden kuivua. Suljetun työskentelyalueen, esim. laminaarivirtauskaapin, tapauksessa altista kupu UV-valolle 30 minuutiksi.
Huomautus
Älä altista reagensseja UV-valolle; siirrä ne kaappiin vasta, kun se on puhdas. Jos suoritetaan käänteiskopiointi-PCR:ää, voi olla myös hyödyllistä pyyhkiä pinnat ja laitteet liuoksella, joka hajottaa RNaaseja kosketuksessa niiden kanssa. Tämä voi auttaa välttämään vääriä negatiivisia tuloksia RNA:n entsyymihajoamisesta. Dekontaminaation jälkeen ja ennen mastermiikin valmistamista käsineet tulee vaihtaa uudelleen, minkä jälkeen kaappi on käyttövalmis.
Pre-PCR: Nukleiinihapon uuttaminen/templaatin lisääminen:
Nukleiinihappo on uutettava ja käsiteltävä toisella nimetyllä alueella käyttäen erillistä pipettiä, suodatinkärkiä, putkitelineitä, uusia käsineitä, laboratoriotakkeja ja muita laitteita. Tätä aluetta käytetään myös templaatin, kontrollien ja trendiviivojen lisäämiseen mastermioosiputkiin tai -levyille. Uutettujen ja analysoitavien nukleiinihapponäytteiden kontaminaation välttämiseksi on suositeltavaa vaihtaa käsineet ennen positiivisten kontrollien tai standardien käsittelyä ja käyttää erillistä pipettisarjaa. PCR-reagensseja ja monistettuja tuotteita ei saa pipetoida tälle alueelle. Näytteet tulee säilyttää samassa tilassa olevissa nimetyissä jääkaapeissa tai pakastimissa. Näytetila on puhdistettava samalla tavalla kuin mastermioositila.
PCR:n jälkeen: monistus ja monistetun tuotteen käsittely
Tämä tila on tarkoitettu monistuksen jälkeisille prosesseille, ja sen tulee olla fyysisesti erillään PCR:ää edeltävistä alueista. Se sisältää yleensä termosyklereitä ja reaaliaikaisia alustoja, ja ihanteellisessa tilassa siinä tulisi olla laminaarivirtauskaappi kierroksen 1 PCR-tuotteen lisäämiseksi kierroksen 2 reaktioon, jos suoritetaan nested PCR. PCR-reagensseja ja uutettua nukleiinihappoa ei saa käsitellä tällä alueella, koska kontaminaatioriski on suuri. Tällä alueella tulee olla erilliset käsineet, laboratoriotakit, levy- ja putkitelineet, pipetit, suodatinkärjet, säiliöt ja muut laitteet. Putket on sentrifugoitava ennen avaamista. Näytetila on puhdistettava samalla tavalla kuin mastermikoositila.
PCR:n jälkeinen: Tuoteanalyysi
Tämä huone on tarkoitettu tuotteiden havaitsemislaitteille, kuten geelielektroforeesisäiliöille, teholähteille, UV-transilluminaattorille ja geelin dokumentointijärjestelmälle. Tässä tilassa tulee olla erilliset käsineet, laboratoriotakit, levy- ja koeputkitelineet, pipetit, suodatinkärjet, säiliöt ja muut laitteet. Tälle alueelle ei saa tuoda muita reagensseja, lukuun ottamatta latausväriä, molekyylimarkkeria ja agaroosigeeliä sekä puskurikomponentteja. Näytetila on puhdistettava samalla tavalla kuin mastermikoostumustila.
Tärkeä huomautus
Ihannetapauksessa PCR-testejä edeltäviin huoneisiin ei tulisi mennä samana päivänä, jos PCR-testien jälkeisissä huoneissa on jo työskennelty. Jos tämä on täysin mahdotonta välttää, varmista, että kädet pestään ensin huolellisesti ja että huoneissa käytetään erityisiä laboratoriotakkeja. Laboratoriokirjoja ja -papereita ei saa viedä PCR-testejä edeltäviin huoneisiin, jos niitä on käytetty PCR-testien jälkeisissä huoneissa. Tarvittaessa ota kopioita protokollista/näytetunnisteista jne.
4. Yleisiä molekyylibiologian ohjeita
Käytä puuterittomia käsineitä määrityksen inhibition välttämiseksi. Oikea pipetointitekniikka on ensiarvoisen tärkeää kontaminaation vähentämiseksi. Väärä pipetointi voi johtaa roiskumiseen nesteitä annosteltaessa ja aerosolien muodostumiseen. Hyviä käytäntöjä oikeaan pipetointiin löytyy seuraavista linkeistä: Gilsonin pipetointiopas, Anachemin pipetointitekniikkavideot, Sentrifugiputket ennen avaamista ja avaa ne varovasti roiskumisen välttämiseksi. Sulje putket heti käytön jälkeen kontaminaatioiden välttämiseksi.
Useita reaktioita suoritettaessa valmista yksi mastermix, joka sisältää yleisiä reagensseja (esim. vesi, dNTP:t, puskuri, alukkeet ja entsyymi) reagenssien siirtojen minimoimiseksi ja kontaminaatioriskin vähentämiseksi. On suositeltavaa valmistaa mastermix jäillä tai kylmäblokilla. Hot Start -entsyymin käyttö voi auttaa vähentämään epäspesifisten tuotteiden tuotantoa. Suojaa fluoresoivia koettimia sisältävät reagenssit valolta hajoamisen välttämiseksi.
5. Sisäinen valvonta
Sisällytä hyvin karakterisoidut ja vahvistetut positiiviset ja negatiiviset kontrollit sekä kaikkiin reaktioihin templaattiton kontrolli ja kvantitatiivisiin reaktioihin monipistetitrattu trendiviiva. Positiivisen kontrollin ei tulisi olla niin voimakas, että se aiheuttaa kontaminaatioriskin. Sisällytä positiiviset ja negatiiviset uuttokontrollit nukleiinihappojen uuttoa suoritettaessa.
On suositeltavaa, että jokaiselle alueelle asetetaan selkeät ohjeet, jotta käyttäjät ovat tietoisia käyttäytymissäännöistä. Diagnostiset laboratoriot, jotka havaitsevat kliinisissä näytteissä erittäin alhaisia DNA- tai RNA-tasoja, saattavat haluta ottaa käyttöön lisäturvatoimenpiteen, jossa on erilliset ilmankäsittelyjärjestelmät, joissa on hieman positiivinen ilmanpaine PCR-testaushuoneissa ja hieman negatiivinen ilmanpaine PCR-testaushuoneissa.
Lopuksi on hyödyllistä laatia laadunvarmistussuunnitelma. Tällaiseen suunnitelmaan tulisi sisältyä luettelot reagenssien perus- ja työvarastoista, pakkausten ja reagenssien säilytyssäännöt, kontrollitulosten raportointi, henkilöstön koulutusohjelmat, vianmääritysalgoritmit ja tarvittaessa korjaavat toimenpiteet.
6. Lähdeluettelo
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Luku 3: qPCR-laboratorion perustaminen. Ohjeasiakirja virkistysvesien testaamiseen USEPA qPCR-menetelmällä 1611. Lansing-Michigan State University.
Public Health England, NHS. Ison-Britannian mikrobiologisten tutkimusten standardit: Hyvä laboratoriokäytäntö molekyylimonistusmääritysten suorittamisessa). Laatuohjeet. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR-laboratorion perustaminen. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Sentrifugien rutiinihuolto: sentrifugien, roottoreiden ja adapterien puhdistus, huolto ja desinfiointi (Valkoinen paperi nro 14). Hampuri: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Hyvä kliininen laboratoriokäytäntö (GCLP) diagnostisissa laboratorioissa käytettäville molekyylipohjaisille testeille, teoksessa: Akyar I, toim. Laadunvalvonnan laaja kirjo. Rijeka, Kroatia: Intech; 2011: 29–52.
Julkaisun aika: 16.7.2020
