Molekulaj detektaj metodoj havas la kapablon produkti grandan volumenon de nuklea acido per la amplifikado de spuroj trovitaj en specimenoj. Kvankam tio utilas por ebligi senteman detekton, ĝi ankaŭ enkondukas la eblecon de poluado per la disvastiĝo de amplifikaj aerosoloj en la laboratorio. Dum eksperimentoj, oni povas entrepreni mezurojn por eviti la poluadon de reakciaĵoj, laboratoria ekipaĵo kaj benkospaco, ĉar tia poluado povas generi falspozitivajn (aŭ falsnegativajn) rezultojn.
Por helpi redukti la probablecon de poluado, oni devas ĉiam apliki Bonajn Laboratoriajn Praktikojn. Specife, oni devas preni antaŭzorgojn rilate al la jenaj punktoj:
1. Manipulado de reakciaĵoj
2. Organizado de laborejo kaj ekipaĵo
3. Konsiloj pri uzo kaj purigado por la difinita molekula spaco
4. Ĝeneralaj konsiloj pri molekula biologio
5. Internaj kontroloj
6. Bibliografio
1. Manipulado de reakciaĵoj
Nelonge centrifugigu la reakciilojn antaŭ ol malfermi ilin por eviti la generadon de aerosoloj. Alikvotu reakciilojn por eviti plurajn frostigojn-degeladojn kaj poluadon de la majstraj provizoj. Klare etikedu kaj datigu ĉiujn reakciilojn kaj reakciajn tubojn kaj konservu protokolojn pri la loto- kaj arnumeroj de la reakciiloj uzitaj en ĉiuj eksperimentoj. Pipetu ĉiujn reakciilojn kaj specimenojn uzante filtrilpintojn. Antaŭ aĉeto, estas konsilinde konfirmi kun la fabrikanto, ke la filtrilpintoj taŭgas por la marko de la uzota pipeto.
2. Organizado de laborejo kaj ekipaĵo
La laborspaco estu organizita por certigi, ke la fluo de laboro okazas en unu direkto, de puraj areoj (antaŭ-PCR) al malpuraj areoj (post-PCR). La jenaj ĝeneralaj antaŭzorgoj helpos redukti la eblecon de poluado. Havu apartajn ĉambrojn, aŭ almenaŭ fizike apartajn areojn, por: preparado de majstra miksaĵo, ekstraktado de nukleaacidoj kaj aldono de DNA-ŝablono, amplifikado kaj manipulado de amplifikita produkto, kaj produkta analizo, ekz. ĝela elektroforezo.
En iuj situacioj, havi 4 apartajn ĉambrojn estas malfacile. Ebla sed malpli dezirinda opcio estas fari la majstran miksaĵon prepari en entena areo, ekzemple lamenflua ŝranko. Kaze de nestita PCR-amplifikado, la preparo de la majstra miksaĵo por la dua ronda reakcio devus esti preparita en la "pura" areo por majstra miksaĵo prepari, sed la inokulado kun la primara PCR-produkto devus esti farita en la amplifika ĉambro, kaj se eble en dediĉita entena areo (ekz. lamenflua ŝranko).
Ĉiu ĉambro/areo bezonas apartan aron de klare etikeditaj pipetoj, filtrilpintoj, tubrakoj, vortikiloj, centrifugiloj (se aplikeble), skribiloj, ĝeneralaj laboratoriaj reakciiloj, laboratoriaj kiteloj kaj skatoloj da gantoj, kiuj restos ĉe iliaj respektivaj laborstacioj. Manoj devas esti lavitaj kaj gantoj kaj laboratoriaj kiteloj ŝanĝitaj dum movado inter la elektitaj areoj. Reakciiloj kaj ekipaĵo ne devas esti movitaj de malpura areo al pura areo. Se ekestas ekstrema kazo, kie reakciilo aŭ ekipaĵo bezonas esti movita malantaŭen, ĝi devas unue esti senkontaminigita per 10% natria hipoklorito, sekvata de viŝado per sterila akvo.
Noto
La 10%-a natria hipoklorita solvaĵo devas esti freŝe preparita ĉiutage. Kiam uzata por senkontaminigo, oni devas respekti minimuman kontaktotempon de 10 minutoj.
Alternative, komerce haveblaj produktoj, kiuj estas validigitaj kiel DNA-detruantaj surfacaj senpoluigiloj, povas esti uzataj se lokaj sekurecaj rekomendoj ne permesas la uzon de natria hipoklorito aŭ se natria hipoklorito ne taŭgas por senpoluigi la metalajn partojn de ekipaĵo.
Ideale, la dungitaro sekvu la etoson de unudirekta laborfluo kaj ne reiru de malpuraj areoj (post-PCR) al puraj areoj (antaŭ-PCR) en la sama tago. Tamen, povas esti okazoj kiam tio estas neevitebla. Kiam tia okazo ekestas, la dungitaro devas zorgi lavi siajn manojn plene, ŝanĝi gantojn, uzi la indikitan laboratorian kitelon kaj ne enkonduki ekipaĵon, kiun ili volos elporti el la ĉambro denove, kiel ekzemple laboratoriajn librojn. Tiaj kontrolrimedoj estu emfazitaj en la trejnado de la dungitaro pri molekulaj metodoj.
Post uzo, la laborbenkaj spacoj estu purigitaj per 10% natria hipoklorito (sekvate de sterila akvo por forigi restan blankigilon), 70% etanolo, aŭ validigita komerce havebla DNA-detruanta senpoluigilo. Ideale, ultraviolaj (UV) lampoj estu instalitaj por ebligi senpoluigon per surradiado. Tamen, la uzo de UV-lampoj estu limigita al fermitaj laborareoj, ekzemple sekurecaj ŝrankoj, por limigi la UV-ekspozicion de la laboratoria personaro. Bonvolu sekvi la instrukciojn de la fabrikanto pri prizorgado, ventolado kaj purigado de UV-lampaj por certigi, ke la lampoj restu efikaj.
Se oni uzas 70%-an etanolon anstataŭ natria hipoklorito, oni bezonos surradiadon per UV-lumo por kompletigi la senpoluadon.
Ne purigu la vorticon kaj centrifugilon per natria hipoklorito; anstataŭe, viŝu ilin per 70%-a etanolo kaj eksponu ilin al UV-lumo, aŭ uzu komercan DNA-detruantan senpoluaĵon. Pri disverŝiĝoj, kontrolu kun la fabrikanto por pliaj konsiloj pri purigado. Se la instrukcioj de la fabrikanto permesas tion, pipetoj estu rutine steriligitaj per aŭtoklavo. Se pipetoj ne povas esti aŭtoklavigitaj, sufiĉu purigi ilin per 10%-a natria hipoklorito (sekvata de ĝisfunda viŝado per sterila akvo) aŭ per komerca DNA-detruanta senpoluaĵo sekvata de UV-eksponiĝo.
Purigado per alt-procenta natria hipoklorito povas eventuale difekti pipetajn plastojn kaj metalojn se farata regule; unue kontrolu la rekomendojn de la fabrikanto. Ĉiu ekipaĵo devas esti regule kalibrita laŭ la rekomendita horaro de la fabrikanto. Nomumita persono devus esti respondeca pri certigado, ke la kalibrada horaro estas sekvata, detalaj protokoloj estas konservataj, kaj servetikedoj estas klare montrataj sur la ekipaĵo.
3. Konsiloj pri uzo kaj purigado por la difinita molekula spaco
Antaŭ-PCR: Alikvotado de reakciaĵoj / preparado de majstra miksaĵo: Ĉi tiu devus esti la plej pura el ĉiuj spacoj uzataj por la preparado de molekulaj eksperimentoj kaj ideale devus esti elektita lamenflua ŝranko ekipita per UV-lumo. Specimenoj, ekstraktitaj nukleaj acidoj kaj amplifikitaj PCR-produktoj ne devas esti manipulataj en ĉi tiu areo. Amplifikaj reakciaĵoj devus esti konservitaj en frostujo (aŭ fridujo, laŭ la rekomendoj de la fabrikanto) en la sama elektita spaco, ideale apud la lamenflua ŝranko aŭ antaŭ-PCR-areo. Gantoj devus esti ŝanĝitaj ĉiufoje enirante la antaŭ-PCR-areon aŭ lamenfluan ŝrankon.
La antaŭ-PCR-areo aŭ lamenflua ŝranko estu purigita antaŭ kaj post uzo jene: Viŝu ĉiujn objektojn en la ŝranko, ekzemple pipetojn, konsiletkestojn, vorticon, centrifugilon, tubrakojn, skribilojn, ktp., per 70% etanolo aŭ komerca DNA-detruanta senpoluigilo, kaj lasu ilin sekiĝi. Kaze de fermita laborareo, ekzemple lamenflua ŝranko, elmetu la kapuĉon al UV-lumo dum 30 minutoj.
Noto
Ne elmetu reakciilojn al UV-lumo; nur movu ilin en la ŝrankon kiam ĝi estas pura. Se vi faras inversan transskriban PCR-on, povas ankaŭ esti utile viŝi surfacojn kaj ekipaĵon per solvaĵo, kiu malkomponas RNazojn ĉe kontakto. Tio povas helpi eviti falsnegativajn rezultojn pro enzima degenero de RNA. Post senkontaminado kaj antaŭ ol prepari la majstran miksaĵon, la gantoj devas esti ŝanĝitaj denove, kaj tiam la ŝranko estas preta por uzo.
Antaŭ-PCR: Nukleacida ekstraktado/ŝablonaldono:
Nuklea acido devas esti ekstraktita kaj manipulita en dua difinita areo, uzante apartan aron de pipetoj, filtrilpintoj, tubrakoj, freŝaj gantoj, laboratoriaj kiteloj kaj alia ekipaĵo. Ĉi tiu areo ankaŭ estas por la aldono de ŝablono, kontroloj kaj tendenclinioj al la majstromiksaĵaj tuboj aŭ platoj. Por eviti poluadon de la ekstraktitaj nukleacidaj specimenoj, kiuj estas analizataj, estas rekomendinde ŝanĝi gantojn antaŭ ol manipuli pozitivajn kontrolojn aŭ normojn kaj uzi apartan aron de pipetoj. PCR-reakciaĵoj kaj amplifikitaj produktoj ne devas esti pipetitaj en ĉi tiu areo. Specimenoj devas esti konservitaj en difinitaj fridujoj aŭ frostujoj en la sama areo. La specimena laborspaco devas esti purigita same kiel la majstromiksaĵa spaco.
Post-PCR: Amplifaĵo kaj manipulado de la amplifikita produkto
Ĉi tiu elektita spaco estas por post-amplifikaj procezoj kaj devus esti fizike apartigita de la antaŭ-PCR-areoj. Ĝi kutime enhavas termociklilojn kaj realtempajn platformojn, kaj ideale devus havi lamenfluan ŝrankon por aldoni la PCR-produkton de la unua raŭndo al la reakcio de la dua raŭndo, se nestita PCR estas farata. PCR-reakciaĵoj kaj ekstraktita nuklea acido ne devas esti manipulataj en ĉi tiu areo, ĉar la risko de poluado estas alta. Ĉi tiu areo devus havi apartan aron de gantoj, laboratoriaj kiteloj, rakoj por platoj kaj tuboj, pipetoj, filtrilpintoj, ujoj kaj alia ekipaĵo. Tuboj devas esti centrifugitaj antaŭ malfermo. La specimenlaborejo devus esti purigita same kiel la spaco por majstra miksaĵo.
Post-PCR: Produkta analizo
Ĉi tiu ĉambro estas por produkta detektila ekipaĵo, ekzemple ĝelaj elektroforezaj tankoj, aldonaĵoj, UV-translumigilo kaj la ĝela dokumentadsistemo. Ĉi tiu areo devus havi apartajn arojn de gantoj, laboratoriaj kiteloj, platoj kaj tubrakoj, pipetoj, filtrilpintoj, ujoj kaj alia ekipaĵo. Neniuj aliaj reakciaĵoj povas esti enportitaj en ĉi tiun areon, krom ŝarĝa tinkturfarbo, molekula markilo kaj agaroza ĝelo, kaj bufrokomponantoj. La specimena laborspaco devus esti purigita same kiel la majstra miksaĵa spaco.
Grava noto
Ideale, la antaŭ-PCR-ĉambroj ne estu enireblaj en la sama tago se laboro jam estis farita en la post-PCR-ĉambroj. Se tio estas tute neevitebla, certigu, ke la manoj estas unue plene lavitaj kaj ke specifaj laboratoriaj kiteloj estas portataj en la ĉambroj. Laboratoriaj libroj kaj dokumentoj ne estu enportitaj en la antaŭ-PCR-ĉambrojn se ili estis uzitaj en la post-PCR-ĉambroj; se necese, prenu duoblajn presaĵojn de protokoloj/specimenaj identigiloj, ktp.
4. Ĝeneralaj konsiloj pri molekula biologio
Uzu senpudrajn gantojn por eviti analizinhibicion. Ĝusta pipeta tekniko estas esenca por redukti poluadon. Malĝusta pipetado povas rezultigi ŝprucigadon dum disdonado de likvaĵoj kaj la kreadon de aerosoloj. Bonan praktikon por ĝusta pipetado oni povas trovi ĉe la jenaj ligiloj: Gvidilo de Gilson pri pipetado, Filmetoj pri la pipetada tekniko de Anachem, Centrifugilaj tuboj antaŭ malfermo, kaj malfermu ilin zorge por eviti ŝprucigadon. Fermu la tubojn tuj post uzo por eviti la enkondukon de poluaĵoj.
Kiam oni plenumas plurajn reakciojn, preparu unu majstran miksaĵon enhavantan komunajn reakciilojn (ekz. akvon, dNTP-ojn, bufron, komencilojn kaj enzimon) por minimumigi la nombron de reakciilaj translokigoj kaj redukti la minacon de poluado. Estas rekomendinde starigi la majstran miksaĵon sur glacio aŭ malvarma bloko. Uzo de varma startiga enzimo povas helpi redukti la produktadon de nespecifaj produktoj. Protektu reakciilojn enhavantajn fluoreskajn sondilojn de lumo por eviti degeneron.
5. Internaj kontroloj
Inkluzivi bone karakterizitajn, konfirmitajn pozitivajn kaj negativajn kontrolojn, kune kun senŝablona kontrolo en ĉiuj reakcioj, kaj plurpunktan titritan tendenclinion por kvantaj reakcioj. La pozitiva kontrolo ne estu tiel forta, ke ĝi prezentas poluadriskon. Inkluzivi pozitivajn kaj negativajn ekstraktajn kontrolojn dum efektivigo de nukleaacida ekstraktado.
Estas rekomendinde, ke klaraj instrukcioj estu afiŝitaj en ĉiu areo, por ke uzantoj sciu pri kondutreguloj. Diagnozaj laboratorioj, kiuj detektas tre malaltajn nivelojn de DNA aŭ RNA en klinikaj specimenoj, eble volos adopti la plian sekurecan rimedon havi apartajn aermanipulajn sistemojn kun iomete pozitiva aerpremo en la antaŭ-PCR-ĉambroj kaj iomete negativa aerpremo en la post-PCR-ĉambroj.
Fine, estas helpema evoluigi planon por kvalito-kontrolo (KK). Tia plano devus inkluzivi listojn de reakciaĵaj ĉefaj provizoj kaj funkciaj provizoj, regulojn por stokado de ilaroj kaj reakciaĵoj, raportadon de kontrolrezultoj, programojn por trejnado de dungitaro, algoritmojn por problemsolvado, kaj riparajn agojn kiam necese.
6. Bibliografio
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Ĉapitro 3: Starigo de qPCR-laboratorio. Gviddokumento por testi distrajn akvojn uzante USEPA qPCR-metodon 1611. Lansing-Miĉigana Ŝtata Universitato.
Publika Sano Anglio, NHS. Normoj de Britio por mikrobiologiaj esploroj: Bona Laboratoria Praktiko dum efektivigo de molekulaj amplifikaj analizoj. Gvidlinioj pri Kvalito. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Starigo de PCR-laboratorio. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutina prizorgado de centrifugiloj: purigado, prizorgado kaj desinfektado de centrifugiloj, rotoroj kaj adaptiloj (Blanka libro n-ro 14). Hamburgo: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bona Klinika Laboratoria Praktiko (GCLP) por molekulbazitaj testoj uzataj en diagnozaj laboratorioj, En: Akyar I, redaktoro. Larĝaj spektroj de kvalito-kontrolo. Rijeko, Kroatio: Intech; 2011: 29–52.
Afiŝtempo: 16-a de Julio, 2020
