Molekylære detektionsmetoder har evnen til at producere en stor mængde nukleinsyre gennem amplifikation af spormængder, der findes i prøver. Selvom dette er gavnligt for at muliggøre følsom detektion, introducerer det også muligheden for kontaminering gennem spredning af amplifikationsaerosoler i laboratoriemiljøet. Ved udførelse af eksperimenter kan der træffes foranstaltninger for at undgå kontaminering af reagenser, laboratorieudstyr og arbejdsplads, da sådan kontaminering kan generere falsk positive (eller falsk negative) resultater.
For at mindske sandsynligheden for kontaminering bør god laboratoriepraksis altid praktiseres. Specifikt bør der træffes forholdsregler vedrørende følgende punkter:
1. Håndtering af reagenser
2. Organisering af arbejdsplads og udstyr
3. Brugs- og rengøringsråd for det angivne molekylære rum
4. Generel rådgivning om molekylærbiologi
5. Interne kontroller
6. Bibliografi
1. Håndtering af reagenser
Centrifuger reagensrørene kort før åbning for at undgå dannelse af aerosoler. Fordel reagenserne alikvoter for at undgå gentagne frysninger og optøninger og kontaminering af masterstocks. Mærk og dater alle reagens- og reaktionsrør tydeligt, og før log over reagenslot- og batchnumre, der er anvendt i alle eksperimenter. Pipetter alle reagenser og prøver ved hjælp af filterspidser. Før køb anbefales det at bekræfte med producenten, at filterspidserne passer til det pipettemærke, der skal anvendes.
2. Organisering af arbejdsplads og udstyr
Arbejdsområdet bør organiseres, så arbejdsflowet foregår i én retning, fra rene områder (før PCR) til snavsede områder (efter PCR). Følgende generelle forholdsregler vil bidrage til at reducere risikoen for kontaminering. Hav separate, udpegede rum, eller som minimum fysisk adskilte områder, til: forberedelse af mastermix, ekstraktion af nukleinsyre og tilsætning af DNA-skabelon, amplifikation og håndtering af amplificeret produkt og produktanalyse, f.eks. gelelektroforese.
I nogle situationer er det vanskeligt at have 4 separate rum. En mulig, men mindre ønskelig løsning er at udføre mastermix-forberedelsen i et indeslutningsområde, f.eks. et laminar flow-kabinet. I tilfælde af indlejret PCR-amplifikation bør forberedelsen af mastermixen til anden runde-reaktionen forberedes i det 'rene' område til mastermix-forberedelse, men inokuleringen med det primære PCR-produkt bør udføres i amplifikationsrummet, og hvis muligt i et dedikeret indeslutningsområde (f.eks. et laminar flow-kabinet).
Hvert rum/område skal have et separat sæt tydeligt mærkede pipetter, filterspidser, rørstativer, vortexer, centrifuger (hvis relevant), penne, generiske laboratoriereagenser, kitler og kasser med handsker, der skal forblive på deres respektive arbejdsstationer. Hænder skal vaskes, og handsker og kitler skal skiftes, når man flytter mellem de angivne områder. Reagenser og udstyr bør ikke flyttes fra et snavset område til et rent område. Skulle der opstå et ekstremt tilfælde, hvor et reagens eller et stykke udstyr skal flyttes baglæns, skal det først dekontamineres med 10% natriumhypochlorit, efterfulgt af aftørring med sterilt vand.
Note
10% natriumhypochloritopløsningen skal tilberedes frisk dagligt. Ved brug til dekontaminering skal en minimumskontakttid på 10 minutter overholdes.
Alternativt kan kommercielt tilgængelige produkter, der er valideret som DNA-ødelæggende overfladedekontamineringsmidler, anvendes, hvis lokale sikkerhedsanbefalinger ikke tillader brugen af natriumhypochlorit, eller hvis natriumhypochlorit ikke er egnet til dekontaminering af metaldele i udstyr.
Ideelt set bør personalet overholde princippet om ensrettet arbejdsgang og ikke gå fra snavsede områder (post-PCR) tilbage til rene områder (pre-PCR) samme dag. Der kan dog være tilfælde, hvor dette er uundgåeligt. Når en sådan situation opstår, skal personalet sørge for at vaske hænder grundigt, skifte handsker, bruge den dertil indrettede kittel og ikke medbringe udstyr, som de ønsker at tage ud af rummet igen, såsom laboratoriebøger. Sådanne kontrolforanstaltninger bør understreges i personalets træning i molekylære metoder.
Efter brug skal arbejdspladser rengøres med 10% natriumhypochlorit (efterfulgt af sterilt vand for at fjerne resterende blegemiddel), 70% ethanol eller et valideret, kommercielt tilgængeligt DNA-ødelæggende dekontamineringsmiddel. Ideelt set bør der monteres ultraviolette (UV) lamper for at muliggøre dekontaminering ved bestråling. Brugen af UV-lamper bør dog begrænses til lukkede arbejdsområder, f.eks. sikkerhedsskabe, for at begrænse laboratoriepersonalets UV-eksponering. Følg venligst producentens anvisninger for pleje, ventilation og rengøring af UV-lamper for at sikre, at lamperne forbliver effektive.
Hvis der anvendes 70% ethanol i stedet for natriumhypochlorit, vil bestråling med UV-lys være nødvendig for at fuldføre dekontamineringen.
Rengør ikke vortexen og centrifugen med natriumhypochlorit; tør i stedet af med 70% ethanol og udsæt for UV-lys, eller brug et kommercielt DNA-destruktivt dekontamineringsmiddel. Ved spild skal du kontakte producenten for yderligere rengøringsråd. Hvis producentens anvisninger tillader det, bør pipetter rutinemæssigt steriliseres ved hjælp af autoklave. Hvis pipetter ikke kan autoklaveres, bør det være tilstrækkeligt at rengøre dem med 10% natriumhypochlorit (efterfulgt af en grundig aftørring med sterilt vand) eller med et kommercielt DNA-destruktivt dekontamineringsmiddel efterfulgt af UV-eksponering.
Rengøring med natriumhypochlorit med høj procentdel kan med tiden beskadige pipetteplast og -metaller, hvis det udføres regelmæssigt; tjek først producentens anbefalinger. Alt udstyr skal kalibreres regelmæssigt i henhold til producentens anbefalede tidsplan. En udpeget person bør være ansvarlig for at sikre, at kalibreringsplanen overholdes, at detaljerede logfiler føres, og at servicemærkater er tydeligt vist på udstyret.
3. Brugs- og rengøringsråd for det angivne molekylære rum
Præ-PCR: Reagensalikvotering / forberedelse af mastermix: Dette bør være det reneste af alle rum, der anvendes til forberedelse af molekylære eksperimenter, og bør ideelt set være et dedikeret laminar flow-skab udstyret med UV-lys. Prøver, ekstraheret nukleinsyre og amplificerede PCR-produkter må ikke håndteres i dette område. Amplifikationsreagenser bør opbevares i en fryser (eller køleskab, i henhold til producentens anbefalinger) i det samme dedikerede rum, ideelt set ved siden af laminar flow-skabet eller præ-PCR-området. Handsker bør skiftes hver gang man træder ind i præ-PCR-området eller laminar flow-skabet.
Præ-PCR-området eller laminar flow-kabinettet skal rengøres før og efter brug som følger: Tør alle genstande i kabinettet af, f.eks. pipetter, spidsbokse, vortex, centrifuge, rørstativer, penne osv. med 70% ethanol eller et kommercielt DNA-ødelæggende dekontamineringsmiddel, og lad det tørre. I tilfælde af et lukket arbejdsområde, f.eks. et laminar flow-kabinet, udsættes hætten for UV-lys i 30 minutter.
Note
Udsæt ikke reagenser for UV-lys; flyt dem først ind i kabinettet, når det er rent. Hvis du udfører revers transkriptions-PCR, kan det også være nyttigt at aftørre overflader og udstyr med en opløsning, der nedbryder RNaser ved kontakt. Dette kan hjælpe med at undgå falsk negative resultater fra enzymnedbrydning af RNA. Efter dekontaminering og før tilberedning af mastermixet skal handsker skiftes igen, og derefter er kabinettet klar til brug.
Præ-PCR: Ekstraktion af nukleinsyre/tilsætning af skabelon:
Nukleinsyre skal ekstraheres og håndteres i et andet, der er udpeget område, ved hjælp af et separat sæt pipetter, filterspidser, rørstativer, rene handsker, laboratoriekitler og andet udstyr. Dette område er også til tilsætning af skabelon, kontroller og trendlinjer til mastermix-rørene eller -pladerne. For at undgå kontaminering af de ekstraherede nukleinsyreprøver, der analyseres, anbefales det at skifte handsker før håndtering af positive kontroller eller standarder og at bruge et separat sæt pipetter. PCR-reagenser og amplificerede produkter må ikke pipetteres i dette område. Prøver skal opbevares i dertil udpegede køleskabe eller frysere i samme område. Prøveområdet skal rengøres på samme måde som mastermix-området.
Post-PCR: Amplifikation og håndtering af det amplificerede produkt
Dette udpegede område er til post-amplifikationsprocesser og bør være fysisk adskilt fra præ-PCR-områderne. Det indeholder normalt termocyklere og realtidsplatforme og bør ideelt set have et laminar flow-kabinet til tilsætning af runde 1 PCR-produktet til runde 2-reaktionen, hvis der udføres nestet PCR. PCR-reagenser og ekstraheret nukleinsyre må ikke håndteres i dette område, da risikoen for kontaminering er høj. Dette område bør have et separat sæt handsker, laboratoriekitler, plade- og rørstativer, pipetter, filterspidser, beholdere og andet udstyr. Rørene skal centrifugeres før åbning. Prøveområdet skal rengøres på samme måde som mastermix-området.
Post-PCR: Produktanalyse
Dette rum er til produktdetektionsudstyr, f.eks. gelelektroforesetanke, strømforsyninger, UV-transilluminator og geldokumentationssystem. Dette område skal have separate sæt handsker, kitler, plade- og rørstativer, pipetter, filterspidser, beholdere og andet udstyr. Ingen andre reagenser må medbringes i dette område, undtagen påfyldningsfarvestof, molekylær markør og agarosegel samt bufferkomponenter. Prøveområdet skal rengøres på samme måde som mastermix-området.
Vigtig bemærkning
Ideelt set bør præ-PCR-rummene ikke betrædes samme dag, hvis der allerede er udført arbejde i post-PCR-rummene. Hvis dette er helt uundgåeligt, skal det sikres, at hænderne først vaskes grundigt, og at der bæres specifikke kitler i rummene. Laboratoriebøger og papirer må ikke medbringes i præ-PCR-rummene, hvis de har været brugt i post-PCR-rummene; tag om nødvendigt duplikater af protokoller/prøve-ID'er osv.
4. Generel rådgivning om molekylærbiologi
Brug pudderfri handsker for at undgå hæmning af assayet. Korrekt pipetteringsteknik er afgørende for at reducere kontaminering. Forkert pipettering kan resultere i stænk ved dispensering af væsker og dannelse af aerosoler. God praksis for korrekt pipettering kan findes på følgende links: Gilson-vejledning til pipetering, Anachem-pipetteringsteknikvideoer, Centrifugerør før åbning, og åbn dem forsigtigt for at undgå stænk. Luk rørene straks efter brug for at undgå indføring af kontaminanter.
Når der udføres flere reaktioner, skal der forberedes én mastermix indeholdende fælles reagenser (f.eks. vand, dNTP'er, buffer, primere og enzym) for at minimere antallet af reagensoverførsler og reducere risikoen for kontaminering. Det anbefales at opstille mastermixen på is eller en kold blok. Brug af et Hot Start-enzym kan bidrage til at reducere produktionen af uspecifikke produkter. Beskyt reagenser, der indeholder fluorescerende prober, mod lys for at undgå nedbrydning.
5. Interne kontroller
Inkluder velkarakteriserede, bekræftede positive og negative kontroller, sammen med en kontrol uden skabelon i alle reaktioner, og en titreret trendlinje med flere punkter for kvantitative reaktioner. Den positive kontrol bør ikke være så stærk, at den udgør en kontamineringsrisiko. Inkluder positive og negative ekstraktionskontroller, når der udføres nukleinsyreekstraktion.
Det anbefales, at der opsættes tydelige instruktioner i hvert område, så brugerne er opmærksomme på reglerne for adfærd. Diagnostiske laboratorier, der påviser meget lave niveauer af DNA eller RNA i kliniske prøver, kan overveje at anvende separate ventilationssystemer med let positivt lufttryk i præ-PCR-rummene og let negativt lufttryk i post-PCR-rummene.
Endelig er det nyttigt at udvikle en kvalitetssikringsplan (QA). En sådan plan bør indeholde lister over reagensstam- og arbejdslagre, regler for opbevaring af kits og reagenser, rapportering af kontrolresultater, personaleuddannelsesprogrammer, fejlfindingsalgoritmer og afhjælpende handlinger, når det er nødvendigt.
6. Bibliografi
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Opsætning af et qPCR-laboratorium. En vejledning til test af rekreative vandområder ved hjælp af USEPA qPCR-metode 1611. Lansing-Michigan State University.
Public Health England, NHS. Britiske standarder for mikrobiologiske undersøgelser: God laboratoriepraksis ved udførelse af molekylære amplifikationsanalyser. Kvalitetsvejledning. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Opsætning af et PCR-laboratorium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutinemæssig vedligeholdelse af centrifuger: rengøring, vedligeholdelse og desinfektion af centrifuger, rotorer og adaptere (Hvidbog nr. 14). Hamborg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. God klinisk laboratoriepraksis (GCLP) for molekylærbaserede tests anvendt i diagnostiske laboratorier. I: Akyar I, redaktør. Bredt spektrum af kvalitetskontrol. Rijeka, Kroatien: Intech; 2011: 29–52.
Opslagstidspunkt: 16. juli 2020
