I metudi di rilevazione moleculare anu a capacità di pruduce un grande vulume d'acidu nucleicu per via di l'amplificazione di quantità tracce truvate in i campioni. Mentre questu hè beneficu per permette una rilevazione sensibile, introduce ancu a pussibilità di contaminazione per via di a diffusione di aerosol di amplificazione in l'ambiente di u laburatoriu. Quandu si facenu esperimenti, si ponu piglià misure per evità a contaminazione di reagenti, apparecchiature di laburatoriu è spaziu di bancu, postu chì tale contaminazione pò generà risultati falsi pusitivi (o falsi negativi).
Per aiutà à riduce a probabilità di contaminazione, e Bone Pratiche di Laboratoriu devenu esse applicate in ogni mumentu. In particulare, devenu esse prese precauzioni in quantu à i seguenti punti:
1. Manipulazione di reagenti
2. Organizazione di u spaziu di travagliu è di l'attrezzatura
3. Cunsiglii d'usu è di pulizia per u spaziu moleculare designatu
4. Cunsiglii generali di biologia moleculare
5. Cuntrolli interni
6. Bibliografia
1. Manipulazione di reagenti
Centrifugà brevemente i tubi di reagenti prima di apre per evità a generazione di aerosol. Aliquotà i reagenti per evità multipli congelamenti-scongelamenti è a contaminazione di e scorte maestre. Etichettà è datà chjaramente tutti i tubi di reagenti è di reazione è mantene registri di lotti di reagenti è numeri di batch utilizati in tutti l'esperimenti. Pipettà tutti i reagenti è i campioni aduprendu puntali cù filtri. Prima di l'acquistu, hè cunsigliatu di cunfirmà cù u fabricatore chì i puntali cù filtri sò adatti à a marca di pipetta da aduprà.
2. Organizazione di u spaziu di travagliu è di l'attrezzatura
U spaziu di travagliu deve esse urganizatu per assicurà chì u flussu di travagliu si faci in una direzzione, da e zone pulite (prima di a PCR) à e zone sporche (dopu a PCR). E seguenti precauzioni generali aiutanu à riduce u risicu di contaminazione. Avè stanze designate separate, o almenu zone fisicamente separate, per: preparazione di a mastermix, estrazione di l'acidu nucleicu è aghjunta di mudelli di DNA, amplificazione è manipulazione di u pruduttu amplificatu, è analisi di u pruduttu, per esempiu elettroforesi in gel.
In certi ambienti, avè 4 stanze separate hè difficiule. Una opzione pussibule ma menu desiderabile hè di fà a preparazione di a mastermix in una zona di cuntenimentu, per esempiu una cabina di flussu laminare. In u casu di l'amplificazione PCR annidata, a preparazione di a mastermix per a seconda reazione deve esse preparata in a zona "pulita" per a preparazione di a mastermix, ma l'inoculazione cù u pruduttu PCR primariu deve esse fatta in a stanza di amplificazione, è se pussibule in una zona di cuntenimentu dedicata (per esempiu una cabina di flussu laminare).
Ogni stanza/zona hà bisognu di un inseme separatu di pipette, puntali cù filtri, rack per tubi, vortex, centrifughe (se pertinenti), penne, reagenti di laburatoriu generici, camici di laburatoriu è scatule di guanti chjaramente etichettati chì resteranu à e so rispettive stazioni di travagliu. E mani devenu esse lavate è i guanti è i camici di laburatoriu cambiati quandu si passa trà e zone designate. I reagenti è l'attrezzatura ùn devenu micca esse spostati da una zona sporca à una zona pulita. In casu di casu estremu induve un reagente o un pezzu di attrezzatura deve esse spostatu in daretu, deve prima esse decontaminatu cù ipocloritu di sodiu à u 10%, seguitu da una pulizia cù acqua sterile.
Nota
A suluzione di ipocloritu di sodiu à 10% deve esse preparata fresca ogni ghjornu. Quandu hè aduprata per a decontaminazione, si deve rispettà un tempu di cuntattu minimu di 10 minuti.
In alternativa, i prudutti dispunibili in u cummerciu chì sò validati cum'è decontaminanti di superfici chì distruggenu u DNA ponu esse aduprati se e raccomandazioni di sicurezza lucali ùn permettenu micca l'usu di ipocloritu di sodiu o se l'ipocloritu di sodiu ùn hè micca adattatu per decontaminà e parti metalliche di l'attrezzatura.
Idealmente, u persunale deve rispettà l'etica di u flussu di travagliu unidirezionale è ùn vultà da e zone sporche (dopu a PCR) à e zone pulite (pre-PCR) u listessu ghjornu. Tuttavia, ci ponu esse occasioni quandu questu hè inevitabile. Quandu si presenta una tale occasione, u persunale deve fà attenzione à lavà bè e mani, cambià i guanti, aduprà u camice di laburatoriu designatu è ùn introduce micca alcun equipaggiamentu chì vorrà caccià da a stanza di novu, cum'è i libri di laburatoriu. Tali misure di cuntrollu devenu esse messe in risaltu in a furmazione di u persunale nantu à i metudi moleculari.
Dopu l'usu, i spazii di u bancu devenu esse puliti cù 10% d'ipocloritu di sodiu (seguitu da acqua sterile per rimuovere a candeggina residua), 70% d'etanolu, o un decontaminante chì distrugge u DNA è hè validatu è dispunibule in cummerciu. Idealmente, devenu esse installate lampade ultraviolette (UV) per permette a decontaminazione per irradiazione. Tuttavia, l'usu di lampade UV deve esse limitatu à zone di travagliu chjuse, per esempiu armadi di sicurezza, per limità l'esposizione di u persunale di u laburatoriu à i raggi UV. Per piacè, rispettate l'istruzzioni di u fabricatore per a cura, a ventilazione è a pulizia di e lampade UV per assicurà chì e lampade restinu efficaci.
Sè vo aduprate etanolu à 70% invece di ipocloritu di sodiu, serà necessaria l'irradiazione cù luce UV per cumpletà a decontaminazione.
Ùn pulite micca u vortice è a centrifuga cù ipocloritu di sodiu; invece, asciugate cù etanolu à 70% è espone à a luce UV, o aduprate un decontaminante cummerciale chì distrugge u DNA. Per i sversamenti, verificate cù u fabricatore per più cunsiglii di pulizia. Se l'istruzzioni di u fabricatore u permettenu, e pipette devenu esse sterilizzate di rutina per autoclave. Se e pipette ùn ponu esse autoclavate, duveria esse sufficiente à pulisce cù ipocloritu di sodiu à 10% (seguitu da una pulizia accurata cù acqua sterile) o cù un decontaminante cummerciale chì distrugge u DNA seguita da l'esposizione UV.
A pulizia cù ipocloritu di sodiu à alta percentuale pò dannighjà eventualmente i plastichi è i metalli di e pipette s'ella hè fatta regularmente; verificate prima e raccomandazioni di u fabricatore. Tutti l'attrezzature devenu esse calibrate regularmente secondu u calendariu raccomandatu da u fabricatore. Una persona designata deve esse incaricata di assicurà chì u calendariu di calibrazione sia rispettatu, chì i registri dettagliati sianu mantenuti è chì l'etichette di serviziu sianu chjaramente affissate nantu à l'attrezzature.
3. Cunsiglii d'usu è di pulizia per u spaziu moleculare designatu
Pre-PCR: Aliquotazione di reagenti / preparazione di mastermix: Questu deve esse u spaziu u più pulitu di tutti quelli utilizati per a preparazione di esperimenti moleculari è idealmente deve esse una camera à flussu laminare designata dotata di una luce UV. I campioni, l'acidu nucleicu estrattu è i prudutti PCR amplificati ùn devenu micca esse manipulati in questa zona. I reagenti di amplificazione devenu esse cunservati in un congelatore (o frigorifero, secondu e raccomandazioni di u fabricatore) in u listessu spaziu designatu, idealmente accantu à a camera à flussu laminare o à a zona pre-PCR. I guanti devenu esse cambiati ogni volta chì si entra in a zona pre-PCR o in a camera à flussu laminare.
L'area di pre-PCR o a camera à flussu laminare deve esse pulita prima è dopu l'usu cum'è seguita: Pulite tutti l'articuli in a camera, per esempiu pipette, scatule di puntali, vortex, centrifuga, rack per tubi, penne, ecc. cù etanolu à 70% o un decontaminante cummerciale chì distrugge u DNA, è lasciate asciugà. In u casu di una zona di travagliu chjusa, per esempiu una camera à flussu laminare, espone a cappa à a luce UV per 30 minuti.
Nota
Ùn espone micca i reagenti à a luce UV; spustateli in l'armariu solu quandu hè pulitu. Sè vo fate una PCR di trascrizione inversa, pò ancu esse utile asciugà e superfici è l'attrezzatura cù una suluzione chì rompe l'RNasi à u cuntattu. Questu pò aiutà à evità risultati falsi negativi da a degradazione enzimatica di l'RNA. Dopu a decontaminazione è prima di preparà a mastermix, i guanti devenu esse cambiati una volta di più, è dopu l'armariu hè prontu à aduprà.
Pre-PCR: Estrazione di l'acidu nucleicu / aggiunta di mudellu:
L'acidu nucleicu deve esse estrattu è manipulatu in una seconda zona designata, utilizendu un inseme separatu di pipette, puntali di filtru, rack per tubi, guanti freschi, camici di laburatoriu è altri equipaggiamenti. Sta zona hè ancu per l'aghjunta di mudelli, cuntrolli è linee di tendenza à i tubi o piastre di mastermix. Per evità a contaminazione di i campioni d'acidu nucleicu estratti chì sò analizati, hè cunsigliatu di cambià i guanti prima di manipulà cuntrolli o standard pusitivi è di utilizà un inseme separatu di pipette. I reagenti PCR è i prudutti amplificati ùn devenu micca esse pipettati in questa zona. I campioni devenu esse cunservati in frigoriferi o congelatori designati in a stessa zona. U spaziu di travagliu di u campione deve esse pulitu in u listessu modu cum'è u spaziu di mastermix.
Post-PCR: Amplificazione è manipulazione di u pruduttu amplificatu
Stu spaziu designatu hè per i prucessi di post-amplificazione è deve esse fisicamente separatu da e zone di pre-PCR. Di solitu cuntene termociclatori è piattaforme in tempu reale, è idealmente deve avè una cabina di flussu laminare per aghjunghje u pruduttu PCR di u primu giru à a reazione di u secondu giru, se si esegue una PCR annidata. I reagenti PCR è l'acidu nucleicu estrattu ùn devenu micca esse manipulati in questa zona postu chì u risicu di contaminazione hè altu. Questa zona deve avè un set separatu di guanti, camici di laburatoriu, rack per piastre è tubi, pipette, puntali per filtri, contenitori è altre attrezzature. I tubi devenu esse centrifugati prima di l'apertura. U spaziu di travagliu di u campione deve esse pulitu in u listessu modu cum'è u spaziu di a mastermix.
Post-PCR: Analisi di u pruduttu
Questa stanza hè per l'equipaggiu di rilevazione di prudutti, per esempiu, serbatoi d'elettroforesi in gel, batterie, transilluminatore UV è u sistema di documentazione di u gel. Questa zona deve avè insemi separati di guanti, camici da laboratorio, rack per piastre è tubi, pipette, puntali per filtri, contenitori è altri equipaggiamenti. Nisun altru reagente pò esse purtatu in questa zona, eccettu u colorante di carica, u marcatore moleculare è u gel d'agarosa, è i cumpunenti tampone. U spaziu di travagliu di u campione deve esse pulitu in u listessu modu cum'è u spaziu di a mastermix.
Nota impurtante
Idealmente, ùn si deve micca entre in e stanze pre-PCR u stessu ghjornu s'è u travagliu hè digià statu realizatu in e stanze post-PCR. S'ellu hè cumpletamente inevitabile, assicuratevi chì e mani sianu prima lavate bè è chì si portinu camici di laburatoriu specifici in e stanze. I libri di laburatoriu è i documenti ùn devenu micca esse purtati in e stanze pre-PCR s'elli sò stati aduprati in e stanze post-PCR; s'ellu hè necessariu, fate stampe duplicate di protokolli/ID di campioni, ecc.
4. Cunsiglii generali di biologia moleculare
Aduprate guanti senza polvere per evità l'inibizione di u test. A tecnica curretta di pipettaggio hè di primura per riduce a contaminazione. Un pipettaggio incorrectu pò causà schizzi durante a dispensazione di liquidi è a creazione di aerosol. E bone pratiche per un pipettaggio currettu ponu esse truvate à i seguenti ligami: Guida Gilson per u pipettaggio, video di a tecnica di pipettaggio Anachem, Centrifugà i tubi prima di l'apertura, è apreli cù cura per evità schizzi. Chiudete i tubi subitu dopu l'usu per evità l'introduzione di contaminanti.
Quandu si realizanu parechje reazzioni, preparate una mastermix chì cuntene reagenti cumuni (per esempiu, acqua, dNTP, buffer, primer è enzima) per minimizà u numeru di trasferimenti di reagenti è riduce a minaccia di contaminazione. Hè cunsigliatu di mette in opera a mastermix nantu à u ghjacciu o un bloccu fretu. L'usu di un enzima Hot Start pò aiutà à riduce a pruduzzione di prudutti non specifichi. Prutegge i reagenti chì cuntenenu sonde fluorescenti da a luce per evità a degradazione.
5. Cuntrolli interni
Includite cuntrolli pusitivi è negativi ben caratterizati è cunfirmati, cù un cuntrollu senza mudellu in tutte e reazioni, è una linea di tendenza titrata multi-puntu per e reazioni quantitative. U cuntrollu pusitivu ùn deve esse cusì forte da pone un risicu di contaminazione. Includite cuntrolli d'estrazione pusitivi è negativi quandu si esegue l'estrazione di l'acidu nucleicu.
Hè cunsigliatu di affissà struzzioni chjare in ognuna di e zone affinchì l'utilizatori sianu cuscenti di e regule di cundotta. I laboratori di diagnostica chì rilevenu livelli assai bassi di DNA o RNA in campioni clinichi puderanu vulè aduttà a misura di sicurezza supplementaria di avè sistemi di trattamentu di l'aria separati cù una pressione d'aria ligeramente positiva in e stanze pre-PCR è una pressione d'aria ligeramente negativa in e stanze post-PCR.
Infine, u sviluppu di un pianu di garanzia di qualità (QA) hè utile. Un tale pianu deve include elenchi di stock maestri di reagenti è stock di travagliu, regule per a conservazione di kit è reagenti, rapporti di risultati di cuntrollu, prugrammi di furmazione di u persunale, algoritmi di risoluzione di prublemi è azzioni correttive quandu hè necessariu.
6. Bibliografia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capitulu 3: Creazione di un laburatoriu qPCR. Un documentu di guida per testà l'acque ricreative utilizendu u metudu USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.
Salute Publica Inghilterra, NHS. Norme di u Regnu Unitu per l'investigazioni microbiologiche: Bona pratica di laburatoriu quandu si realizanu saggi di amplificazione moleculare). Guida di qualità. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Creazione di un laburatoriu PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Manutenzione rutinaria di centrifughe: pulizia, manutenzione è disinfezione di centrifughe, rotori è adattatori (Libru biancu n. 14). Amburgo: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bona Pratica di Laboratoriu Clinicu (GCLP) per i testi moleculari utilizati in i laboratorii diagnostichi, In: Akyar I, editore. Ampi spettri di cuntrollu di qualità. Rijeka, Croazia: Intech; 2011: 29–52.
Data di publicazione: 16 di lugliu di u 2020
