Малекулярныя метады выяўлення дазваляюць атрымліваць вялікі аб'ём нуклеінавай кіслаты шляхам ампліфікацыі слядовых колькасцей, якія сустракаюцца ва ўзорах. Хоць гэта і карысна для забеспячэння адчувальнага выяўлення, гэта таксама стварае магчымасць забруджвання праз распаўсюджванне аэразоляў ампліфікацыі ў лабараторным асяроддзі. Пры правядзенні эксперыментаў можна прымаць меры для пазбягання забруджвання рэагентаў, лабараторнага абсталявання і прасторы лабараторнага стала, бо такое забруджванне можа прывесці да ілжывастаноўчых (ці ілжываадмоўных) вынікаў.
Каб знізіць верагоднасць забруджвання, неабходна заўсёды выконваць правілы добрай лабараторнай практыкі. У прыватнасці, неабходна прымаць меры засцярогі адносна наступных пунктаў:
1. Абыходжанне з рэагентамі
2. Арганізацыя працоўнай прасторы і абсталявання
3. Парады па выкарыстанні і ачыстцы для пазначанай малекулярнай прасторы
4. Агульныя парады па малекулярнай біялогіі
5. Унутраны кантроль
6. Бібліяграфія
1. Абыходжанне з рэагентамі
Перад адкрыццём коратка адцэнтрыфугуйце прабіркі з рэагентамі, каб пазбегнуць утварэння аэразоляў. Размяркуйце рэагенты па аліквотах, каб пазбегнуць шматразовага замарожвання-размарожвання і забруджвання асноўных раствораў. Выразна маркіруйце і датуйце ўсе прабіркі з рэагентамі і рэакцыямі і вядзіце журналы нумароў партый і партый рэагентаў, якія выкарыстоўваліся ва ўсіх эксперыментах. Піпетуйце ўсе рэагенты і ўзоры з дапамогай фільтруючых наканечнікаў. Перад купляй рэкамендуецца ўдакладніць у вытворцы, ці падыходзяць фільтруючыя наканечнікі да маркі піпеткі, якая будзе выкарыстоўвацца.
2. Арганізацыя працоўнай прасторы і абсталявання
Працоўная прастора павінна быць арганізавана такім чынам, каб забяспечыць адзін напрамак патоку працы — ад чыстых зон (да ПЛР) да брудных зон (пасля ПЛР). Наступныя агульныя меры засцярогі дапамогуць знізіць рызыку забруджвання. Неабходна мець асобныя спецыяльна адведзеныя пакоі або, як мінімум, фізічна асобныя зоны для: падрыхтоўкі галоўнай сумесі, экстракцыі нуклеінавых кіслот і дадання ДНК-матрыцы, ампліфікацыі і апрацоўкі ампліфікаванага прадукту, а таксама аналізу прадукту, напрыклад, гель-электрафарэзу.
У некаторых умовах наяўнасць 4 асобных памяшканняў з'яўляецца складанай. Магчымым, але менш пажаданым варыянтам з'яўляецца падрыхтоўка майстар-сумесі ў зоне ізаляцыі, напрыклад, у ламінарным шафе. У выпадку ўкладзенай ПЦР-ампліфікацыі падрыхтоўка майстар-сумесі для другога раўнда рэакцыі павінна праводзіцца ў «чыстай» зоне для падрыхтоўкі майстар-сумесі, але інакуляцыя першасным прадуктам ПЦР павінна праводзіцца ў пакоі для ампліфікацыі і, па магчымасці, у спецыяльна адведзенай зоне ізаляцыі (напрыклад, у ламінарным шафе).
У кожным пакоі/зоне патрэбен асобны набор выразна маркіраваных піпетак, фільтруючых наканечнікаў, стоек для прабірак, віхравых апаратаў, цэнтрыфуг (пры неабходнасці), ручак, універсальных лабараторных рэагентаў, лабараторных халатаў і скрынак з пальчаткамі, якія будуць заставацца на адпаведных працоўных месцах. Рукі неабходна мыць, а пальчаткі і лабараторныя халаты мяняць пры перамяшчэнні паміж адведзенымі зонамі. Рэагенты і абсталяванне нельга перамяшчаць з бруднай зоны ў чыстую. У выпадку крайняй сітуацыі, калі рэагент або абсталяванне неабходна перамясціць назад, яго спачатку неабходна дэкантамінаваць 10% гіпахларытам натрыю, а затым працерці стэрыльнай вадой.
Заўвага
10% раствор гіпахларыту натрыю неабходна рыхтаваць свежым штодня. Пры выкарыстанні для дэзактывацыі неабходна выконваць мінімальны час кантакту 10 хвілін.
Акрамя таго, можна выкарыстоўваць камерцыйна даступныя прадукты, якія правераныя як павярхоўныя дэзактывацыйныя сродкі, што разбураюць ДНК, калі мясцовыя рэкамендацыі па бяспецы не дазваляюць выкарыстоўваць гіпахларыт натрыю або калі гіпахларыт натрыю не падыходзіць для дэзактывацыі металічных частак абсталявання.
У ідэале, персанал павінен прытрымлівацца аднанакіраванага падыходу да працы і не вяртацца з брудных зон (пасля ПЛР) у чыстыя зоны (да ПЛР) у той жа дзень. Аднак могуць быць выпадкі, калі гэтага не пазбегнуць. У такім выпадку персанал павінен старанна вымыць рукі, змяніць пальчаткі, выкарыстоўваць адведзены лабараторны халат і не прыносіць з сабой ніякага абсталявання, якое ён захоча зноў вынесці з пакоя, напрыклад, лабараторных кніг. Такія меры кантролю павінны быць падкрэслены падчас навучання персаналу малекулярным метадам.
Пасля выкарыстання працоўныя прасторы варта ачысціць 10% гіпахларытам натрыю (а затым стэрыльнай вадой для выдалення рэшткаў адбельвальніка), 70% этанолам або правераным камерцыйна даступным дэзактывацыйным сродкам, які разбурае ДНК. У ідэале неабходна ўсталяваць ультрафіялетавыя (УФ) лямпы для дэзактывацыі шляхам апрамянення. Аднак выкарыстанне УФ-лямпаў павінна абмежавацца закрытымі рабочымі зонамі, напрыклад, бяспечнымі шафамі, каб абмежаваць уздзеянне УФ-выпраменьвання на лабараторны персанал. Калі ласка, выконвайце інструкцыі вытворцы па догляду за УФ-лямпамі, вентыляцыі і чыстцы, каб забяспечыць іх эфектыўнасць.
Калі замест гіпахларыту натрыю выкарыстоўваецца 70% этанол, для завяршэння дэзактывацыі спатрэбіцца апраменьванне ультрафіялетавым святлом.
Не чысціце віхру і цэнтрыфугу гіпахларытам натрыю; замест гэтага працярыце 70% этанолам і падвергніце ўздзеянню ультрафіялетавага выпраменьвання або выкарыстоўвайце камерцыйны дэзактывацыйны сродак, які разбурае ДНК. У выпадку разліву звярніцеся да вытворцы па дадатковую інфармацыю па ачыстцы. Калі інструкцыі вытворцы дазваляюць, піпеткі неабходна рэгулярна стэрылізаваць у аўтаклаве. Калі піпеткі нельга аўтаклававаць, дастаткова ачысціць іх 10% гіпахларытам натрыю (з наступным дбайным праціраннем стэрыльнай вадой) або камерцыйным дэзактывацыйным сродкам, які разбурае ДНК, з наступным уздзеяннем ультрафіялетавага выпраменьвання.
Рэгулярная чыстка высокапрацэнтным гіпахларытам натрыю можа пашкодзіць пластык і метал піпетак; спачатку праверце рэкамендацыі вытворцы. Усё абсталяванне неабходна рэгулярна калібраваць у адпаведнасці з рэкамендаваным вытворцам графікам. Прызначаная асоба павінна несці адказнасць за выкананне графіка каліброўкі, вядзенне падрабязных журналаў і наяўнасць на абсталяванні службовых этыкетак.
3. Парады па выкарыстанні і ачыстцы для пазначанай малекулярнай прасторы
Перад ПЦР: аліквотаванне рэагентаў / падрыхтоўка галоўнай сумесі: гэта павінна быць самая чыстая прастора з усіх, што выкарыстоўваюцца для падрыхтоўкі малекулярных эксперыментаў, і ў ідэале гэта павінна быць спецыяльна адведзеная ламінарная шафа, абсталяваная УФ-лямпай. У гэтай зоне нельга працаваць з узорамі, экстрагаванай нуклеінавай кіслатой і ампліфікаванымі прадуктамі ПЦР. Рэагенты для ампліфікацыі павінны захоўвацца ў маразільнай камеры (або халадзільніку, згодна з рэкамендацыямі вытворцы) у той жа спецыяльна адведзенай прасторы, ідэальна побач з ламінарнай шафай або зонай перад ПЦР. Пальчаткі неабходна мяняць кожны раз пры ўваходзе ў зону перад ПЦР або ламінарную шафу.
Зону перад ПЛР або ламінарны кабінет неабходна ачысціць да і пасля выкарыстання наступным чынам: працярыце ўсе прадметы ў кабінете, напрыклад, піпеткі, скрынкі для наканечнікаў, віхравы фільтр, цэнтрыфугу, штатывы для прабірак, ручкі і г.д. 70% этанолам або камерцыйным дэзактывацыйным сродкам, які разбурае ДНК, і дайце ім высахнуць. У выпадку закрытай рабочай зоны, напрыклад, ламінарнага кабінета, падвергніце выцяжку ўздзеянню ультрафіялетавага выпраменьвання на працягу 30 хвілін.
Заўвага
Не падвяргайце рэагенты ўздзеянню ультрафіялетавага выпраменьвання; перамяшчайце іх у шафу толькі пасля таго, як яна ачысціцца. Пры правядзенні ПЦР з зваротнай транскрыпцыяй таксама можа быць карысна праціраць паверхні і абсталяванне растворам, які расшчапляе РНКазы пры кантакце. Гэта можа дапамагчы пазбегнуць ілжываадмоўных вынікаў ад ферментатыўнай дэградацыі РНК. Пасля дэкантамінацыі і перад падрыхтоўкай галоўнай сумесі неабходна яшчэ раз змяніць пальчаткі, і тады шафа гатовая да выкарыстання.
Папярэдняя ПЦР: экстракцыя нуклеінавых кіслот/даданне шаблону:
Нуклеінавую кіслату неабходна экстрагаваць і апрацоўваць у другой спецыяльна адведзенай зоне з выкарыстаннем асобнага набору піпетак, фільтруючых наканечнікаў, штатываў для прабірак, свежых пальчатак, лабараторных халатаў і іншага абсталявання. Гэтая зона таксама прызначана для дадання шаблонаў, кантроляў і ліній трэнду ў прабіркі або пласціны з галоўнай сумессю. Каб пазбегнуць забруджвання экстрагаваных узораў нуклеінавых кіслот, якія аналізуюцца, рэкамендуецца мяняць пальчаткі перад апрацоўкай станоўчых кантроляў або стандартаў і выкарыстоўваць асобны набор піпетак. Рэагенты для ПЦР і ампліфікаваныя прадукты нельга піпетаваць у гэтай зоне. Узоры варта захоўваць у спецыяльна адведзеных халадзільніках або маразільных камерах у той жа зоне. Працоўную прастору для ўзораў трэба чысціць гэтак жа, як і прастору з галоўнай сумессю.
Пасля ПЦР: Ампліфікацыя і апрацоўка ампліфікаванага прадукту
Гэтая спецыяльна адведзеная прастора прызначана для працэсаў пасля ампліфікацыі і павінна быць фізічна аддзеленай ад зон, прызначаных для правядзення перад ПЦР. Звычайна яна змяшчае тэрмацыклеры і платформы рэальнага часу, і ў ідэале павінна мець ламінарны кабінет для дадання прадукту ПЦР першага раўнда ў рэакцыю другога раўнда, калі праводзіцца ўкладзеная ПЦР. З рэагентамі для ПЦР і экстрагаванай нуклеінавай кіслатой нельга працаваць у гэтай зоне, бо рызыка забруджвання высокая. У гэтай зоне павінен быць асобны камплект пальчатак, лабараторных халатаў, штатываў для планшэтаў і прабірак, піпетак, наканечнікаў з фільтрамі, кантэйнераў і іншага абсталявання. Прабіркі неабходна цэнтрыфугаваць перад адкрыццём. Працоўную прастору для ўзораў трэба чысціць гэтак жа, як і прастору для галоўнай сумесі.
Пасля ПЦР: аналіз прадукту
Гэты пакой прызначаны для абсталявання для выяўлення прадуктаў, напрыклад, рэзервуараў для гель-электрапарэзу, блокаў харчавання, УФ-трансілюмінатара і сістэмы дакументавання геляў. У гэтай зоне павінны быць асобныя камплекты пальчатак, лабараторных халатаў, штатываў для пласцін і прабірак, піпетак, наканечнікаў з фільтрамі, кантэйнераў і іншага абсталявання. У гэтую зону нельга прыносіць ніякіх іншых рэагентаў, за выключэннем загрузкі фарбавальніка, малекулярнага маркера і агарознага геля, а таксама кампанентаў буфера. Працоўную прастору для ўзораў трэба чысціць гэтак жа, як і прастору для змешвання.
Важная заўвага
У ідэале, у пакоі перад ПЛР нельга заходзіць у той жа дзень, калі праца ўжо была выканана ў памяшканнях пасля ПЛР. Калі гэтага немагчыма пазбегнуць, пераканайцеся, што спачатку старанна вымытыя рукі і што ў памяшканнях выкарыстоўваюцца спецыяльныя лабараторныя халаты. Лабараторныя кнігі і дакументы нельга прыносіць у пакоі перад ПЛР, калі яны выкарыстоўваліся ў памяшканнях пасля ПЛР; пры неабходнасці вазьміце дублікаты раздруковак пратаколаў/ідэнтыфікатараў узораў і г.д.
4. Агульныя парады па малекулярнай біялогіі
Выкарыстоўвайце пальчаткі без пудры, каб пазбегнуць інгібіравання аналізу. Правільная тэхніка піпетавання мае першараднае значэнне для зніжэння забруджвання. Няправільнае піпетаванне можа прывесці да пырскаў пры дазаванні вадкасцей і ўтварэння аэразоляў. Добрыя практыкі правільнага піпетавання можна знайсці па наступных спасылках: кіраўніцтва па піпетаванні Gilson, відэа па тэхніцы піпетавання Anachem, цэнтрыфугуйце прабіркі перад адкрыццём і адкрывайце іх асцярожна, каб пазбегнуць пырскаў. Зачыняйце прабіркі адразу пасля выкарыстання, каб пазбегнуць траплення забруджвальных рэчываў.
Пры правядзенні некалькіх рэакцый падрыхтуйце адну галоўную сумесь, якая змяшчае звычайныя рэагенты (напрыклад, ваду, dNTP, буфер, праймеры і фермент), каб мінімізаваць колькасць пераносаў рэагентаў і знізіць рызыку забруджвання. Рэкамендуецца размяшчаць галоўную сумесь на лёдзе або ў халодным блоку. Выкарыстанне фермента Hot Start можа дапамагчы паменшыць утварэнне неспецыфічных прадуктаў. Абараніце рэагенты, якія змяшчаюць флуарэсцэнтныя зонды, ад святла, каб пазбегнуць іх дэградацыі.
5. Унутраны кантроль
Уключыце добра характарызаваныя, пацверджаныя станоўчыя і адмоўныя кантролі, а таксама кантроль без шаблону ва ўсіх рэакцыях і шматкропкавую тытраваную лінію трэнду для колькасных рэакцый. Станоўчы кантроль не павінен быць настолькі моцным, каб ствараць рызыку забруджвання. Уключыце станоўчыя і адмоўныя кантролі экстракцыі пры правядзенні экстракцыі нуклеінавых кіслот.
Рэкамендуецца размясціць зразумелыя інструкцыі ў кожнай зоне, каб карыстальнікі ведалі правілы паводзін. Дыягнастычныя лабараторыі, якія выяўляюць вельмі нізкі ўзровень ДНК або РНК у клінічных узорах, могуць прыняць дадатковыя меры бяспекі, такія як наяўнасць асобных сістэм апрацоўкі паветра з лёгкім станоўчым ціскам паветра ў памяшканнях да ПЛР і лёгкім адмоўным ціскам паветра ў памяшканнях пасля ПЛР.
Нарэшце, карысна распрацаваць план забеспячэння якасці. Такі план павінен уключаць спісы асноўных і рабочых запасаў рэагентаў, правілы захоўвання набораў і рэагентаў, справаздачнасць аб выніках кантролю, праграмы навучання персаналу, алгарытмы ліквідацыі непаладак і карэкцыйныя дзеянні пры неабходнасці.
6. Бібліяграфія
Аслан А., Кінзельман Дж., Дрылін Э., Ананьева Т., Лавандэр Дж. Раздзел 3: Стварэнне лабараторыі qPCR. Кіраўніцтва па тэсціраванні рэкрэацыйных вод з выкарыстаннем метаду qPCR USEPA 1611. Лансінг - Мічыганскі дзяржаўны ўніверсітэт.
Public Health England, NHS. Стандарты Вялікабрытаніі для мікрабіялагічных даследаванняў: Добрая лабараторная практыка пры правядзенні аналізаў малекулярнай ампліфікацыі. Кіраўніцтва па якасці. 2013;4(4):1–15.
Міфлін Т. Стварэнне лабараторыі ПЦР. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шродэр С. 2013. Рэгулярнае абслугоўванне цэнтрыфуг: ачыстка, абслугоўванне і дэзінфекцыя цэнтрыфуг, ротараў і адаптараў (Белая кніга № 14). Гамбург: Эпендорф; 2013.
Віана Р.В., Уоліс К.Л. Добрая клінічная лабараторная практыка (GCLP) для малекулярных тэстаў, якія выкарыстоўваюцца ў дыягнастычных лабараторыях, У кнізе: Акяр І., рэдактар. Шырокі спектр кантролю якасці. Рыека, Харватыя: Intech; 2011: 29–52.
Час публікацыі: 16 ліпеня 2020 г.
