Molekularne metode detekcije lahko proizvedejo veliko količino nukleinske kisline z amplifikacijo sledov, ki jih najdemo v vzorcih. Čeprav je to koristno za omogočanje občutljive detekcije, pa hkrati uvaja možnost kontaminacije s širjenjem amplifikacijskih aerosolov v laboratorijskem okolju. Pri izvajanju poskusov je mogoče sprejeti ukrepe za preprečevanje kontaminacije reagentov, laboratorijske opreme in delovnega prostora, saj lahko takšna kontaminacija povzroči lažno pozitivne (ali lažno negativne) rezultate.
Da bi zmanjšali verjetnost kontaminacije, je treba ves čas izvajati dobro laboratorijsko prakso. Še posebej je treba upoštevati previdnostne ukrepe glede naslednjih točk:
1. Ravnanje z reagenti
2. Organizacija delovnega prostora in opreme
3. Nasveti za uporabo in čiščenje določenega molekularnega prostora
4. Splošni nasveti o molekularni biologiji
5. Notranje kontrole
6. Bibliografija
1. Ravnanje z reagenti
Pred odprtjem epruvete z reagenti na kratko centrifugirajte, da preprečite nastajanje aerosolov. Reagent razdelite v alikvote, da preprečite večkratno zamrzovanje in odtajanje ter kontaminacijo glavnih zalog. Jasno označite in datirajte vse epruvete z reagenti in reakcijami ter vodite dnevnike številk serij in šarž reagentov, uporabljenih v vseh poskusih. Vse reagente in vzorce pipetirajte s filtrirnimi konicami. Pred nakupom je priporočljivo, da se pri proizvajalcu prepričate, da filtrirne konice ustrezajo znamki pipete, ki jo boste uporabili.
2. Organizacija delovnega prostora in opreme
Delovni prostor mora biti organiziran tako, da se zagotovi enosmerni tok dela, od čistih območij (pred PCR) do umazanih območij (po PCR). Naslednji splošni previdnostni ukrepi bodo pripomogli k zmanjšanju možnosti kontaminacije. Imeti je treba ločene prostore ali vsaj fizično ločena območja za: pripravo glavne mešanice, ekstrakcijo nukleinskih kislin in dodajanje matrice DNK, amplifikacijo in ravnanje z amplificiranim produktom ter analizo produkta, npr. gelsko elektroforezo.
V nekaterih okoljih je težko imeti 4 ločene prostore. Možna, vendar manj zaželena možnost je priprava glavne mešanice v zaprtem prostoru, npr. v laminarni komori. V primeru gnezdene PCR amplifikacije je treba pripravo glavne mešanice za drugi krog reakcije izvesti v "čistem" prostoru za pripravo glavne mešanice, vendar je treba inokulacijo s primarnim produktom PCR izvesti v prostoru za amplifikacijo in, če je mogoče, v namenskem zaprtem prostoru (npr. v laminarni komori).
Vsaka soba/območje potrebuje ločen komplet jasno označenih pipet, filtrirnih konic, stojal za epruvete, vrtincev, centrifug (če je ustrezno), pisal, generičnih laboratorijskih reagentov, laboratorijskih halj in škatel z rokavicami, ki bodo ostali na ustreznih delovnih mestih. Pri premikanju med določenimi območji si je treba umiti roke in zamenjati rokavice ter laboratorijske halje. Reagentov in opreme se ne sme premikati iz umazanega v čisto območje. V skrajnem primeru, ko je treba reagent ali kos opreme premakniti nazaj, ga je treba najprej dekontaminirati z 10 % natrijevim hipokloritom, nato pa obrisati s sterilno vodo.
Opomba
10-odstotno raztopino natrijevega hipoklorita je treba pripravljati svežo vsak dan. Pri uporabi za dekontaminacijo je treba upoštevati minimalni čas stika 10 minut.
Druga možnost so komercialno dostopni izdelki, ki so validirani kot površinska dekontaminanta, ki uničujejo DNK, če lokalna varnostna priporočila ne dovoljujejo uporabe natrijevega hipoklorita ali če natrijev hipoklorit ni primeren za dekontaminacijo kovinskih delov opreme.
V idealnem primeru bi se osebje moralo držati etike enosmernega delovnega toka in se istega dne ne bi smelo vračati iz umazanih prostorov (po PCR) v čiste prostore (pred PCR). Vendar pa se lahko zgodi, da se temu ni mogoče izogniti. V takem primeru mora osebje poskrbeti, da si temeljito umije roke, zamenja rokavice, uporabi namensko laboratorijsko haljo in ne prinaša nobene opreme, ki bi jo želelo ponovno odnesti iz prostora, kot so laboratorijske knjige. Takšne nadzorne ukrepe je treba poudariti pri usposabljanju osebja o molekularnih metodah.
Po uporabi je treba delovne površine očistiti z 10 % natrijevim hipokloritom (nakar sledi sterilna voda za odstranitev ostankov belila), 70 % etanolom ali validiranim komercialno dostopnim dekontaminantom, ki uničuje DNK. V idealnem primeru bi morale biti nameščene ultravijolične (UV) svetilke, ki omogočajo dekontaminacijo z obsevanjem. Vendar pa je treba uporabo UV-svetilk omejiti na zaprta delovna območja, npr. varnostne omare, da se omeji izpostavljenost laboratorijskega osebja UV-žarkom. Upoštevajte navodila proizvajalca za nego, prezračevanje in čiščenje UV-svetilk, da zagotovite njihovo učinkovitost.
Če namesto natrijevega hipoklorita uporabljate 70 % etanol, bo za popolno dekontaminacijo potrebno obsevanje z UV-svetlobo.
Vrtinca in centrifuge ne čistite z natrijevim hipokloritom; namesto tega obrišite s 70 % etanolom in izpostavite UV-svetlobi ali uporabite komercialno dekontaminantno sredstvo, ki uničuje DNK. V primeru razlitja se za dodatne nasvete o čiščenju posvetujte s proizvajalcem. Če navodila proizvajalca to dovoljujejo, je treba pipete rutinsko sterilizirati v avtoklavu. Če pipet ni mogoče avtoklavirati, bi moralo zadostovati, da jih očistite z 10 % natrijevim hipokloritom (ki mu sledi temeljito brisanje s sterilno vodo) ali s komercialnim dekontaminantnim sredstvom, ki uničuje DNK, in nato izpostavite UV-svetlobi.
Redno čiščenje z visokoodstotnim natrijevim hipokloritom lahko sčasoma poškoduje plastiko in kovino pipet; najprej preverite priporočila proizvajalca. Vso opremo je treba redno kalibrirati v skladu z urnikom, ki ga priporoča proizvajalec. Pooblaščena oseba mora biti odgovorna za zagotavljanje upoštevanja urnika kalibracije, vodenja podrobnih dnevnikov in jasno prikazovanje servisnih nalepk na opremi.
3. Nasveti za uporabo in čiščenje določenega molekularnega prostora
Pred-PCR: Alikvotiranje reagentov / priprava glavne mešanice: To mora biti najčistejši prostor od vseh, ki se uporabljajo za pripravo molekularnih poskusov, in idealno bi moral biti to namensko laminarni pretok kabineta, opremljen z UV-lučjo. V tem prostoru se ne sme rokovati z vzorci, ekstrahiranimi nukleinskimi kislinami in amplificiranimi produkti PCR. Amplifikacijski reagenti morajo biti shranjeni v zamrzovalniku (ali hladilniku, kot priporoča proizvajalec) v istem namensko določenem prostoru, idealno poleg laminarnega pretok kabineta ali območja pred-PCR. Rokavice je treba zamenjati vsakič, ko vstopite v območje pred-PCR ali laminarni pretok kabineta.
Pred-PCR območje ali laminarno komoro je treba pred in po uporabi očistiti na naslednji način: Vse predmete v komori, npr. pipete, škatle za konice, vrtinčnik, centrifugo, stojala za epruvete, peresa itd., obrišite s 70 % etanolom ali komercialnim dekontaminantom, ki uničuje DNK, in pustite, da se posušijo. V primeru zaprtega delovnega območja, npr. laminarne komore, izpostavite pokrov UV-svetlobi 30 minut.
Opomba
Reagentov ne izpostavljajte UV-svetlobi; v omarico jih prenesite šele, ko je čista. Če izvajate PCR z reverzno transkripcijo, je lahko koristno tudi, da površine in opremo obrišete z raztopino, ki ob stiku razgradi RNaze. To lahko pomaga preprečiti lažno negativne rezultate zaradi encimske razgradnje RNK. Po dekontaminaciji in pred pripravo glavne mešanice je treba rokavice še enkrat zamenjati, nato pa je omara pripravljena za uporabo.
Pred-PCR: Ekstrakcija nukleinske kisline/dodatek predloge:
Nukleinsko kislino je treba ekstrahirati in z njo ravnati v drugem določenem območju z uporabo ločenega kompleta pipet, filtrirnih konic, stojal za epruvete, svežih rokavic, laboratorijskih halj in druge opreme. To območje je namenjeno tudi dodajanju predloge, kontrol in trendnih linij v epruvete ali plošče z glavno mešanico. Da bi se izognili kontaminaciji ekstrahiranih vzorcev nukleinske kisline, ki se analizirajo, je priporočljivo, da pred ravnanjem s pozitivnimi kontrolami ali standardi zamenjate rokavice in uporabite ločen komplet pipet. Reagentov za PCR in amplificiranih produktov ni dovoljeno pipetirati v tem območju. Vzorce je treba shranjevati v določenih hladilnikih ali zamrzovalnikih v istem območju. Delovni prostor za vzorce je treba očistiti na enak način kot prostor z glavno mešanico.
Post-PCR: Amplifikacija in ravnanje z amplificiranim produktom
Ta namenski prostor je namenjen postopkom po amplifikaciji in mora biti fizično ločen od območij pred PCR. Običajno vsebuje termociklerje in platforme za analizo v realnem času, idealno pa bi moral imeti tudi laminarno pretočno komoro za dodajanje produkta PCR iz 1. kroga reakciji iz 2. kroga, če se izvaja gnezdena PCR. Z reagenti PCR in ekstrahirano nukleinsko kislino se v tem prostoru ne sme rokovati, saj je tveganje kontaminacije veliko. To območje mora imeti ločen komplet rokavic, laboratorijskih halj, stojal za plošče in epruvete, pipet, filtrirnih konic, posod in druge opreme. Epruvete je treba pred odprtjem centrifugirati. Delovni prostor za vzorce je treba očistiti na enak način kot prostor za mešanje vzorcev.
Post-PCR: Analiza produkta
Ta prostor je namenjen opremi za zaznavanje produktov, npr. posodam za gelsko elektroforezo, napajalnikom, UV transiluminatorju in sistemu za dokumentiranje gelov. V tem prostoru morajo biti ločeni kompleti rokavic, laboratorijskih halj, stojal za plošče in epruvete, pipet, konic filtrov, posod in druge opreme. V ta prostor ni dovoljeno vnašati drugih reagentov, razen barvil za nalaganje, molekularnega markerja in agaroznega gela ter komponent pufra. Delovni prostor za vzorce je treba očistiti na enak način kot prostor za mešanje vzorcev.
Pomembno obvestilo
V idealnem primeru se v prostore pred PCR ne sme vstopati isti dan, če je bilo delo že opravljeno v prostorih po PCR. Če se temu ni mogoče izogniti, poskrbite, da si najprej temeljito umijete roke in da v prostorih nosite posebne laboratorijske halje. Laboratorijskih knjig in dokumentacije ne smete prinašati v prostore pred PCR, če so bili uporabljeni v prostorih po PCR; po potrebi vzemite dvojnike izpisov protokolov/identifikacij vzorcev itd.
4. Splošni nasveti o molekularni biologiji
Uporabljajte rokavice brez pudra, da preprečite zaviranje testa. Pravilna tehnika pipetiranja je ključnega pomena za zmanjšanje kontaminacije. Nepravilno pipetiranje lahko povzroči brizganje tekočin pri dajanju in nastanek aerosolov. Dobro prakso za pravilno pipetiranje najdete na naslednjih povezavah: Gilsonov vodnik za pipetiranje, videoposnetki o tehniki pipetiranja Anachem, Epruvete pred odprtjem centrifugirajte in jih previdno odprite, da preprečite brizganje. Epruvete po uporabi takoj zaprite, da preprečite vnos kontaminantov.
Pri izvajanju več reakcij pripravite eno glavno mešanico, ki vsebuje običajne reagente (npr. vodo, dNTP-je, pufer, primerje in encim), da zmanjšate število prenosov reagentov in zmanjšate nevarnost kontaminacije. Priporočljivo je, da glavno mešanico postavite na led ali hladen blok. Uporaba encima Hot Start lahko pomaga zmanjšati nastajanje nespecifičnih produktov. Reagente, ki vsebujejo fluorescentne sonde, zaščitite pred svetlobo, da preprečite njihovo razgradnjo.
5. Notranje kontrole
Vključite dobro okarakterizirane, potrjene pozitivne in negativne kontrole, skupaj s kontrolo brez predloge v vseh reakcijah in večtočkovno titrirano trendno črto za kvantitativne reakcije. Pozitivna kontrola ne sme biti tako močna, da bi predstavljala tveganje za kontaminacijo. Pri ekstrakciji nukleinskih kislin vključite pozitivne in negativne kontrole za ekstrakcijo.
Priporočljivo je, da so v vsakem od območij objavljena jasna navodila, da se uporabniki zavedajo pravil ravnanja. Diagnostični laboratoriji, ki v kliničnih vzorcih odkrijejo zelo nizke ravni DNK ali RNK, bodo morda želeli sprejeti dodatne varnostne ukrepe, kot so ločeni sistemi za ravnanje z zrakom z rahlo pozitivnim zračnim tlakom v prostorih pred PCR in rahlo negativnim zračnim tlakom v prostorih po PCR.
Nenazadnje je koristen tudi razvoj načrta za zagotavljanje kakovosti. Tak načrt mora vključevati sezname glavnih in delovnih zalog reagentov, pravila za shranjevanje kompletov in reagentov, poročanje o rezultatih kontrol, programe usposabljanja osebja, algoritme za odpravljanje težav in po potrebi sanacijske ukrepe.
6. Bibliografija
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Poglavje 3: Vzpostavitev laboratorija qPCR. Smernice za testiranje rekreacijskih voda z uporabo metode USEPA qPCR 1611. Lansing - Državna univerza Michigan.
Javno zdravje Anglije, NHS. Standardi Združenega kraljestva za mikrobiološke preiskave: Dobra laboratorijska praksa pri izvajanju molekularnih amplifikacijskih testov. Smernice za kakovost. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Vzpostavitev laboratorija za PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Rutinsko vzdrževanje centrifug: čiščenje, vzdrževanje in dezinfekcija centrifug, rotorjev in adapterjev (Bela knjiga št. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Dobra klinična laboratorijska praksa (GCLP) za molekularno osnovane teste, ki se uporabljajo v diagnostičnih laboratorijih, v: Akyar I, urednik. Širok spekter nadzora kakovosti. Rijeka, Hrvaška: Intech; 2011: 29–52.
Čas objave: 16. julij 2020
