Os métodos de detecção molecular têm a capacidade de produzir um grande volume de ácido nucleico através da amplificação de quantidades mínimas presentes nas amostras. Embora isso seja benéfico para permitir uma detecção sensível, também introduz a possibilidade de contaminação pela dispersão de aerossóis de amplificação no ambiente laboratorial. Ao realizar experimentos, medidas podem ser tomadas para evitar a contaminação de reagentes, equipamentos de laboratório e bancadas, visto que tal contaminação pode gerar resultados falso-positivos (ou falso-negativos).
Para ajudar a reduzir a probabilidade de contaminação, as Boas Práticas de Laboratório devem ser sempre seguidas. Especificamente, devem ser tomadas precauções em relação aos seguintes pontos:
1. Manuseio de reagentes
2. Organização do espaço de trabalho e equipamentos
3. Instruções de uso e limpeza para o espaço molecular designado
4. Conselhos gerais de biologia molecular
5. Controles internos
6. Bibliografia
1. Manuseio de reagentes
Antes de abrir os tubos de reagentes, centrifugue-os brevemente para evitar a geração de aerossóis. Aliquote os reagentes para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e a contaminação das soluções-mãe. Identifique e date claramente todos os tubos de reagentes e de reação e mantenha registros dos números de lote e de lote dos reagentes utilizados em todos os experimentos. Pipete todos os reagentes e amostras utilizando ponteiras com filtro. Antes da compra, é recomendável confirmar com o fabricante se as ponteiras com filtro são compatíveis com a marca da pipeta a ser utilizada.
2. Organização do espaço de trabalho e equipamentos
O espaço de trabalho deve ser organizado de forma a garantir que o fluxo de trabalho ocorra em uma única direção, das áreas limpas (pré-PCR) para as áreas contaminadas (pós-PCR). As seguintes precauções gerais ajudarão a reduzir o risco de contaminação. Disponha de salas separadas ou, no mínimo, áreas fisicamente separadas para: preparação da mistura de reação, extração de ácido nucleico e adição do molde de DNA, amplificação e manipulação do produto amplificado e análise do produto, como por exemplo, eletroforese em gel.
Em alguns contextos, ter 4 salas separadas é difícil. Uma opção possível, porém menos desejável, é preparar a mistura mestra em uma área de contenção, como uma cabine de fluxo laminar. No caso da amplificação por PCR aninhada, a mistura mestra para a segunda rodada de reação deve ser preparada na área "limpa" para preparação da mistura mestra, mas a inoculação com o produto da PCR primária deve ser feita na sala de amplificação e, se possível, em uma área de contenção dedicada (como uma cabine de fluxo laminar).
Cada sala/área precisa de um conjunto separado de pipetas, ponteiras de filtro, suportes para tubos, vórtices, centrífugas (se aplicável), canetas, reagentes genéricos de laboratório, jalecos e caixas de luvas, todos claramente identificados e que permanecerão em suas respectivas estações de trabalho. As mãos devem ser lavadas e as luvas e jalecos trocados ao se deslocar entre as áreas designadas. Reagentes e equipamentos não devem ser movidos de uma área contaminada para uma área limpa. Caso ocorra uma situação extrema em que um reagente ou equipamento precise ser movido de volta para uma área contaminada, ele deve primeiro ser descontaminado com hipoclorito de sódio a 10%, seguido de uma limpeza com água estéril.
Observação
A solução de hipoclorito de sódio a 10% deve ser preparada diariamente. Quando utilizada para descontaminação, deve-se respeitar um tempo mínimo de contato de 10 minutos.
Alternativamente, podem ser utilizados produtos disponíveis comercialmente e validados como descontaminantes de superfície que destroem o DNA, caso as recomendações de segurança locais não permitam o uso de hipoclorito de sódio ou se este não for adequado para descontaminar as partes metálicas do equipamento.
Idealmente, os funcionários devem seguir o princípio do fluxo de trabalho unidirecional e não transitar de áreas contaminadas (pós-PCR) para áreas limpas (pré-PCR) no mesmo dia. No entanto, pode haver ocasiões em que isso seja inevitável. Quando isso ocorrer, os funcionários devem lavar bem as mãos, trocar as luvas, usar o jaleco designado e não levar consigo nenhum equipamento que pretendam retirar da sala, como cadernos de laboratório. Essas medidas de controle devem ser enfatizadas no treinamento dos funcionários em métodos moleculares.
Após o uso, as bancadas devem ser limpas com hipoclorito de sódio a 10% (seguido de água estéril para remover resíduos de alvejante), etanol a 70% ou um descontaminante comercial validado para destruição de DNA. Idealmente, lâmpadas ultravioleta (UV) devem ser instaladas para permitir a descontaminação por irradiação. No entanto, o uso de lâmpadas UV deve ser restrito a áreas de trabalho fechadas, como cabines de segurança, a fim de limitar a exposição da equipe do laboratório à radiação UV. Siga as instruções do fabricante para o cuidado, ventilação e limpeza das lâmpadas UV para garantir que elas permaneçam eficazes.
Caso se utilize etanol a 70% em vez de hipoclorito de sódio, será necessária irradiação com luz ultravioleta para completar a descontaminação.
Não limpe o agitador de vórtice e a centrífuga com hipoclorito de sódio; em vez disso, limpe-os com etanol a 70% e exponha-os à luz UV, ou utilize um descontaminante comercial que destrua o DNA. Em caso de derramamentos, consulte o fabricante para obter mais instruções de limpeza. Se as instruções do fabricante permitirem, as pipetas devem ser esterilizadas rotineiramente em autoclave. Caso as pipetas não possam ser esterilizadas em autoclave, basta limpá-las com hipoclorito de sódio a 10% (seguido de uma limpeza completa com água estéril) ou com um descontaminante comercial que destrua o DNA, seguido de exposição à luz UV.
A limpeza com hipoclorito de sódio em alta concentração pode danificar os plásticos e metais das pipetas se realizada regularmente; consulte as recomendações do fabricante. Todos os equipamentos precisam ser calibrados regularmente, de acordo com o cronograma recomendado pelo fabricante. Uma pessoa designada deve ser responsável por garantir que o cronograma de calibração seja seguido, que registros detalhados sejam mantidos e que as etiquetas de serviço estejam claramente visíveis nos equipamentos.
3. Instruções de uso e limpeza para o espaço molecular designado
Pré-PCR: Aliquotagem de reagentes/preparação da mistura mestra: Este deve ser o espaço mais limpo de todos os utilizados para a preparação de experimentos moleculares e, idealmente, deve ser uma cabine de fluxo laminar equipada com luz UV. Amostras, ácido nucleico extraído e produtos de PCR amplificados não devem ser manuseados nesta área. Os reagentes de amplificação devem ser mantidos em freezer (ou refrigerador, conforme recomendações do fabricante) no mesmo espaço designado, idealmente próximo à cabine de fluxo laminar ou à área de pré-PCR. As luvas devem ser trocadas sempre que entrar na área de pré-PCR ou na cabine de fluxo laminar.
A área de pré-PCR ou a cabine de fluxo laminar devem ser limpas antes e depois do uso, da seguinte forma: Limpe todos os itens dentro da cabine, como pipetas, caixas de ponteiras, vortex, centrífuga, suportes para tubos, canetas, etc., com etanol a 70% ou um descontaminante comercial que destrua o DNA e deixe secar. No caso de uma área de trabalho fechada, como uma cabine de fluxo laminar, exponha a cabine à luz UV por 30 minutos.
Observação
Não exponha os reagentes à luz UV; transfira-os para a cabine somente após a limpeza. Se estiver realizando RT-PCR (reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa), pode ser útil limpar as superfícies e os equipamentos com uma solução que degrada as RNases por contato. Isso pode ajudar a evitar resultados falso-negativos devido à degradação enzimática do RNA. Após a descontaminação e antes de preparar a mistura de reação, as luvas devem ser trocadas novamente e, em seguida, a cabine estará pronta para uso.
Pré-PCR: Extração de ácido nucleico/adição de molde:
O ácido nucleico deve ser extraído e manipulado em uma segunda área designada, utilizando um conjunto separado de pipetas, ponteiras com filtro, suportes para tubos, luvas novas, jalecos e outros equipamentos. Esta área também se destina à adição de molde, controles e linhas de tendência aos tubos ou placas da mistura mestra. Para evitar a contaminação das amostras de ácido nucleico extraídas que serão analisadas, recomenda-se a troca de luvas antes de manusear os controles positivos ou padrões e o uso de um conjunto separado de pipetas. Os reagentes de PCR e os produtos amplificados não devem ser pipetados nesta área. As amostras devem ser armazenadas em refrigeradores ou congeladores designados na mesma área. A área de trabalho das amostras deve ser limpa da mesma forma que a área da mistura mestra.
Pós-PCR: Amplificação e processamento do produto amplificado
Este espaço designado é para processos pós-amplificação e deve ser fisicamente separado das áreas de pré-PCR. Geralmente contém termocicladores e plataformas de PCR em tempo real e, idealmente, deve possuir uma cabine de fluxo laminar para adicionar o produto da primeira rodada de PCR à reação da segunda rodada, caso esteja sendo realizada uma PCR aninhada. Os reagentes de PCR e o ácido nucleico extraído não devem ser manuseados nesta área, pois o risco de contaminação é alto. Esta área deve ter um conjunto separado de luvas, jalecos, suportes para placas e tubos, pipetas, ponteiras com filtro, recipientes e outros equipamentos. Os tubos devem ser centrifugados antes de serem abertos. A área de trabalho das amostras deve ser limpa da mesma forma que a área de preparação da mistura de reação.
Pós-PCR: Análise do produto
Esta sala destina-se ao equipamento de detecção de produtos, como tanques de eletroforese em gel, fontes de alimentação, transiluminador UV e sistema de documentação de gel. Esta área deve conter conjuntos separados de luvas, jalecos, suportes para placas e tubos, pipetas, ponteiras com filtro, recipientes e outros equipamentos. Nenhum outro reagente pode ser levado para esta área, exceto corante de carregamento, marcador molecular, gel de agarose e componentes do tampão. A área de trabalho das amostras deve ser limpa da mesma forma que a área de preparação da mistura mestra.
Nota importante
Idealmente, as salas de pré-PCR não devem ser acessadas no mesmo dia em que já houve trabalho realizado nas salas de pós-PCR. Caso isso seja absolutamente inevitável, certifique-se de que as mãos sejam lavadas cuidadosamente antes e que os jalecos específicos sejam usados nessas salas. Cadernos de laboratório e documentos não devem ser levados para as salas de pré-PCR se tiverem sido utilizados nas salas de pós-PCR; se necessário, faça cópias impressas de protocolos/identificações de amostras, etc.
4. Conselhos gerais de biologia molecular
Use luvas sem pó para evitar a inibição do ensaio. A técnica correta de pipetagem é fundamental para reduzir a contaminação. A pipetagem incorreta pode resultar em respingos ao dispensar líquidos e na formação de aerossóis. Boas práticas para pipetagem correta podem ser encontradas nos seguintes links: Guia de pipetagem da Gilson, vídeos sobre técnicas de pipetagem da Anachem. Centrifugue os tubos antes de abri-los e abra-os com cuidado para evitar respingos. Feche os tubos imediatamente após o uso para evitar a introdução de contaminantes.
Ao realizar múltiplas reações, prepare uma mistura mestra contendo reagentes comuns (por exemplo, água, dNTPs, tampão, primers e enzima) para minimizar o número de transferências de reagentes e reduzir o risco de contaminação. Recomenda-se preparar a mistura mestra em gelo ou em um bloco refrigerado. O uso de uma enzima Hot Start pode ajudar a reduzir a produção de produtos não específicos. Proteja os reagentes que contêm sondas fluorescentes da luz para evitar a degradação.
5. Controles internos
Inclua controles positivos e negativos bem caracterizados e confirmados, juntamente com um controle negativo (sem molde) em todas as reações, e uma curva de tendência titulada em múltiplos pontos para reações quantitativas. O controle positivo não deve ser tão forte a ponto de representar um risco de contaminação. Inclua controles de extração positivos e negativos ao realizar a extração de ácidos nucleicos.
Recomenda-se que instruções claras sejam afixadas em cada uma das áreas para que os usuários estejam cientes das normas de conduta. Laboratórios de diagnóstico que detectam níveis muito baixos de DNA ou RNA em amostras clínicas podem adotar a medida de segurança adicional de possuir sistemas de tratamento de ar separados, com pressão ligeiramente positiva nas salas pré-PCR e pressão ligeiramente negativa nas salas pós-PCR.
Por fim, o desenvolvimento de um plano de garantia da qualidade (GQ) é útil. Tal plano deve incluir listas de estoques mestres e de trabalho de reagentes, regras para armazenamento de kits e reagentes, relatórios de resultados de controle, programas de treinamento de pessoal, algoritmos de solução de problemas e ações corretivas quando necessário.
6. Bibliografia
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Viana RV, Wallis CL. Boas Práticas de Laboratório Clínico (BPLC) para testes moleculares utilizados em laboratórios de diagnóstico. In: Akyar I, editor. Amplo espectro de controle de qualidade. Rijeka, Croácia: Intech; 2011: 29–52.
Data da publicação: 16 de julho de 2020
