आण्विक शोध पद्धतींमध्ये नमुन्यांमध्ये आढळणाऱ्या ट्रेस प्रमाणांचे प्रवर्धन करून मोठ्या प्रमाणात न्यूक्लिक अॅसिड तयार करण्याची क्षमता असते. संवेदनशील शोध सक्षम करण्यासाठी हे फायदेशीर असले तरी, प्रयोगशाळेच्या वातावरणात प्रवर्धन एरोसोलच्या प्रसाराद्वारे दूषित होण्याची शक्यता देखील ते सादर करते. प्रयोग करताना, अभिकर्मक, प्रयोगशाळेतील उपकरणे आणि बेंच स्पेसचे दूषित होणे टाळण्यासाठी उपाययोजना केल्या जाऊ शकतात, कारण अशा दूषिततेमुळे खोटे-सकारात्मक (किंवा खोटे-नकारात्मक) परिणाम होऊ शकतात.
दूषित होण्याची शक्यता कमी करण्यासाठी, नेहमीच चांगल्या प्रयोगशाळेच्या पद्धतींचा अवलंब केला पाहिजे. विशेषतः, खालील मुद्द्यांबद्दल खबरदारी घेतली पाहिजे:
१. अभिकर्मक हाताळणे
२. कार्यक्षेत्र आणि उपकरणांचे आयोजन
३. नियुक्त केलेल्या आण्विक जागेसाठी वापर आणि साफसफाईचा सल्ला
४. सामान्य आण्विक जीवशास्त्र सल्ला
५. अंतर्गत नियंत्रणे
६. ग्रंथसूची
१. अभिकर्मक हाताळणे
एरोसोलची निर्मिती टाळण्यासाठी उघडण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज अभिकर्मक नळ्या थोडक्यात तपासा. अनेक गोठवण्यापासून आणि मास्टर स्टॉकच्या दूषिततेपासून बचाव करण्यासाठी अभिकर्मकांचे प्रमाण कमी करा. सर्व अभिकर्मक आणि अभिक्रिया नळ्यांना स्पष्टपणे लेबल करा आणि तारीख द्या आणि सर्व प्रयोगांमध्ये वापरल्या जाणाऱ्या अभिकर्मक लॉट आणि बॅच क्रमांकांचे लॉग ठेवा. फिल्टर टिप्स वापरून सर्व अभिकर्मक आणि नमुने पिपेट करा. खरेदी करण्यापूर्वी, उत्पादकाशी खात्री करणे उचित आहे की फिल्टर टिप्स वापरल्या जाणाऱ्या पिपेटच्या ब्रँडशी जुळतात.
२. कार्यक्षेत्र आणि उपकरणांचे आयोजन
स्वच्छ क्षेत्रांपासून (पीसीआरपूर्वी) घाणेरड्या क्षेत्रांपर्यंत (पीसीआरनंतर) कामाचा प्रवाह एकाच दिशेने होईल याची खात्री करण्यासाठी कार्यक्षेत्र आयोजित केले पाहिजे. खालील सामान्य खबरदारी दूषित होण्याची शक्यता कमी करण्यास मदत करतील. स्वतंत्र नियुक्त खोल्या किंवा किमान भौतिकदृष्ट्या वेगळे क्षेत्रे असावीत, यासाठी: मास्टरमिक्स तयारी, न्यूक्लिक अॅसिड काढणे आणि डीएनए टेम्पलेट जोडणे, प्रवर्धित उत्पादनाचे प्रवर्धन आणि हाताळणी आणि उत्पादन विश्लेषण, उदा. जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस.
काही ठिकाणी, ४ स्वतंत्र खोल्या असणे कठीण असते. मास्टरमिक्सची तयारी कंटेनमेंट क्षेत्रात करणे हा एक शक्य पण कमी इष्ट पर्याय आहे, उदाहरणार्थ लॅमिनार फ्लो कॅबिनेटमध्ये. नेस्टेड पीसीआर अॅम्प्लिफिकेशनच्या बाबतीत, दुसऱ्या फेरीच्या रिअॅक्शनसाठी मास्टरमिक्सची तयारी मास्टरमिक्स तयारीसाठी 'स्वच्छ' क्षेत्रात तयार करावी, परंतु प्राथमिक पीसीआर उत्पादनासह टोचणे अॅम्प्लिफिकेशन रूममध्ये आणि शक्य असल्यास समर्पित कंटेनमेंट क्षेत्रात (उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट) करावे.
प्रत्येक खोली/क्षेत्राला स्पष्टपणे लेबल केलेले पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रॅक, व्होर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज (जर संबंधित असेल तर), पेन, जेनेरिक लॅब अभिकर्मक, लॅब कोट आणि हातमोजेचे बॉक्स यांचा एक वेगळा संच आवश्यक आहे जो त्यांच्या संबंधित वर्कस्टेशनवर राहील. नियुक्त केलेल्या क्षेत्रांमध्ये फिरताना हात धुवावेत आणि हातमोजे आणि लॅब कोट बदलावेत. अभिकर्मक आणि उपकरणे घाणेरड्या क्षेत्रातून स्वच्छ क्षेत्रात हलवू नयेत. जर एखादी अत्यंत गंभीर परिस्थिती उद्भवली जिथे अभिकर्मक किंवा उपकरणाचा तुकडा मागे हलवावा लागला तर ते प्रथम 10% सोडियम हायपोक्लोराइटने निर्जंतुक केले पाहिजे, त्यानंतर निर्जंतुक पाण्याने पुसले पाहिजे.
टीप
१०% सोडियम हायपोक्लोराइट द्रावण दररोज ताजे बनवावे. निर्जंतुकीकरणासाठी वापरताना, किमान १० मिनिटांचा संपर्क वेळ पाळला पाहिजे.
पर्यायीरित्या, स्थानिक सुरक्षा शिफारशी सोडियम हायपोक्लोराइट वापरण्यास परवानगी देत नसल्यास किंवा उपकरणांच्या धातूच्या भागांचे निर्जंतुकीकरण करण्यासाठी सोडियम हायपोक्लोराइट योग्य नसल्यास, डीएनए-नाश करणारे पृष्ठभाग निर्जंतुकीकरण करणारे म्हणून प्रमाणित केलेली व्यावसायिकरित्या उपलब्ध उत्पादने वापरली जाऊ शकतात.
आदर्शपणे, कर्मचाऱ्यांनी एकदिशात्मक कामाच्या प्रवाहाच्या नीतिमत्तेचे पालन करावे आणि घाणेरड्या भागातून (पीसीआर नंतर) त्याच दिवशी पुन्हा स्वच्छ भागात (पीसीआर आधी) जाऊ नये. तथापि, असे काही प्रसंग येऊ शकतात जेव्हा हे अपरिहार्य असते. जेव्हा अशी परिस्थिती उद्भवते तेव्हा कर्मचाऱ्यांनी हात पूर्णपणे धुण्याची, हातमोजे बदलण्याची, नियुक्त केलेल्या लॅब कोटचा वापर करण्याची आणि लॅब बुकसारखे कोणतेही उपकरण पुन्हा खोलीतून बाहेर काढू नये याची काळजी घ्यावी. आण्विक पद्धतींवरील कर्मचाऱ्यांच्या प्रशिक्षणात अशा नियंत्रण उपायांवर भर दिला पाहिजे.
वापरल्यानंतर, बेंचची जागा १०% सोडियम हायपोक्लोराइट (त्यानंतर अवशिष्ट ब्लीच काढून टाकण्यासाठी निर्जंतुकीकरण पाणी), ७०% इथेनॉल किंवा व्यावसायिकरित्या उपलब्ध असलेल्या डीएनए-नाश करणाऱ्या निर्जंतुकीकरणाने स्वच्छ करावी. आदर्शपणे, किरणोत्सर्गाद्वारे निर्जंतुकीकरण करण्यासाठी अल्ट्रा-व्हायोलेट (यूव्ही) दिवे बसवावेत. तथापि, प्रयोगशाळेतील कर्मचाऱ्यांच्या अतिनील प्रदर्शनास मर्यादित करण्यासाठी अतिनील दिव्यांचा वापर बंद कामाच्या क्षेत्रांपुरता मर्यादित असावा, उदा. सुरक्षा कॅबिनेट. दिवे प्रभावी राहतील याची खात्री करण्यासाठी कृपया अतिनील दिव्यांची काळजी, वायुवीजन आणि साफसफाईसाठी उत्पादकांच्या सूचनांचे पालन करा.
सोडियम हायपोक्लोराईटऐवजी ७०% इथेनॉल वापरत असल्यास, निर्जंतुकीकरण पूर्ण करण्यासाठी अतिनील प्रकाशासह विकिरण आवश्यक असेल.
सोडियम हायपोक्लोराइटने व्होर्टेक्स आणि सेंट्रीफ्यूज स्वच्छ करू नका; त्याऐवजी, ७०% इथेनॉलने पुसून टाका आणि अतिनील प्रकाशाच्या संपर्कात आणा किंवा व्यावसायिक डीएनए-नाश करणारे निर्जंतुकीकरण वापरा. गळतीसाठी, पुढील स्वच्छतेच्या सल्ल्यासाठी उत्पादकाशी संपर्क साधा. जर उत्पादकाच्या सूचना परवानगी देत असतील, तर पिपेट्स नियमितपणे ऑटोक्लेव्हने निर्जंतुकीकरण करावेत. जर पिपेट्स ऑटोक्लेव्ह करता येत नसतील, तर त्यांना १०% सोडियम हायपोक्लोराइटने (त्यानंतर निर्जंतुकीकरण पाण्याने पूर्णपणे पुसून टाका) किंवा व्यावसायिक डीएनए-नाश करणारे निर्जंतुकीकरण करून आणि त्यानंतर अतिनील संपर्कात आणा.
उच्च-टक्केवारी सोडियम हायपोक्लोराइटने साफसफाई नियमितपणे केल्यास पिपेट प्लास्टिक आणि धातूंचे नुकसान होऊ शकते; प्रथम उत्पादकाच्या शिफारशी तपासा. उत्पादकाने शिफारस केलेल्या वेळापत्रकानुसार सर्व उपकरणे नियमितपणे कॅलिब्रेट करणे आवश्यक आहे. कॅलिब्रेशन वेळापत्रकाचे पालन केले जात आहे, तपशीलवार नोंदी राखल्या जात आहेत आणि उपकरणांवर सेवा लेबल्स स्पष्टपणे प्रदर्शित केले आहेत याची खात्री करण्यासाठी नियुक्त व्यक्ती जबाबदार असावी.
३. नियुक्त केलेल्या आण्विक जागेसाठी वापर आणि साफसफाईचा सल्ला
प्री-पीसीआर: अभिकर्मक अॅलिक्वोटिंग / मास्टरमिक्स तयारी: आण्विक प्रयोगांच्या तयारीसाठी वापरल्या जाणाऱ्या सर्व जागांपैकी हे सर्वात स्वच्छ असावे आणि आदर्शपणे यूव्ही लाईटने सुसज्ज असलेले नियुक्त लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट असावे. या भागात नमुने, काढलेले न्यूक्लिक अॅसिड आणि अॅम्प्लीफाइड पीसीआर उत्पादने हाताळू नयेत. अॅम्प्लीफायड अभिकर्मक फ्रीजरमध्ये (किंवा उत्पादकाच्या शिफारशींनुसार रेफ्रिजरेटरमध्ये) त्याच नियुक्त जागेत ठेवावेत, आदर्शपणे लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट किंवा प्री-पीसीआर क्षेत्राच्या शेजारी. प्री-पीसीआर क्षेत्र किंवा लॅमिनार फ्लो कॅबिनेटमध्ये प्रवेश करताना प्रत्येक वेळी हातमोजे बदलले पाहिजेत.
प्री-पीसीआर क्षेत्र किंवा लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट वापरण्यापूर्वी आणि नंतर खालीलप्रमाणे स्वच्छ केले पाहिजे: कॅबिनेटमधील सर्व वस्तू, उदा. पिपेट्स, टिप बॉक्स, व्होर्टेक्स, सेंट्रीफ्यूज, ट्यूब रॅक, पेन इत्यादी ७०% इथेनॉल किंवा व्यावसायिक डीएनए-नाश करणाऱ्या जंतुनाशकाने पुसून टाका आणि कोरडे होऊ द्या. बंद कामाच्या क्षेत्राच्या बाबतीत, उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट, हुडला ३० मिनिटे यूव्ही प्रकाशात उघडा.
टीप
अभिकर्मकांना अतिनील प्रकाशाच्या संपर्कात आणू नका; ते स्वच्छ झाल्यानंतरच कॅबिनेटमध्ये हलवा. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर करत असल्यास, संपर्कात आल्यावर आरएनएसेस तोडणाऱ्या द्रावणाने पृष्ठभाग आणि उपकरणे पुसणे देखील उपयुक्त ठरू शकते. यामुळे आरएनएच्या एन्झाइम डिग्रेडेशनमुळे होणारे खोटे-नकारात्मक परिणाम टाळण्यास मदत होऊ शकते. निर्जंतुकीकरणानंतर आणि मास्टरमिक्स तयार करण्यापूर्वी, हातमोजे पुन्हा एकदा बदलले पाहिजेत आणि नंतर कॅबिनेट वापरण्यासाठी तयार असेल.
प्री-पीसीआर: न्यूक्लिक अॅसिड एक्सट्रॅक्शन/टेम्पलेट अॅडिशन:
न्यूक्लिक अॅसिड दुसऱ्या नियुक्त केलेल्या क्षेत्रात काढले पाहिजे आणि हाताळले पाहिजे, ज्यामध्ये पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रॅक, फ्रेश ग्लोव्हज, लॅब कोट्स आणि इतर उपकरणांचा वेगळा संच वापरला पाहिजे. हे क्षेत्र मास्टरमिक्स ट्यूब किंवा प्लेट्समध्ये टेम्पलेट, नियंत्रणे आणि ट्रेंडलाइन जोडण्यासाठी देखील आहे. विश्लेषण केले जात असलेल्या काढलेल्या न्यूक्लिक अॅसिड नमुन्यांचे दूषित होणे टाळण्यासाठी, सकारात्मक नियंत्रणे किंवा मानके हाताळण्यापूर्वी हातमोजे बदलण्याची आणि पिपेट्सचा वेगळा संच वापरण्याची शिफारस केली जाते. या भागात पीसीआर अभिकर्मक आणि प्रवर्धित उत्पादने पाईपेट केली जाऊ नयेत. नमुने त्याच भागात नियुक्त केलेल्या फ्रीज किंवा फ्रीजरमध्ये साठवले पाहिजेत. नमुना कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्स जागेप्रमाणेच स्वच्छ केले पाहिजे.
पीसीआर नंतर: प्रवर्धित उत्पादनाचे प्रवर्धन आणि हाताळणी
ही नियुक्त केलेली जागा पोस्ट-एम्प्लीफिकेशन प्रक्रियेसाठी आहे आणि ती प्री-पीसीआर क्षेत्रांपासून भौतिकदृष्ट्या वेगळी असावी. त्यात सहसा थर्मोसायक्लर्स आणि रिअल-टाइम प्लॅटफॉर्म असतात आणि जर नेस्टेड पीसीआर केले जात असेल तर राउंड 1 पीसीआर उत्पादन राउंड 2 रिअॅक्शनमध्ये जोडण्यासाठी आदर्शपणे लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट असावे. दूषित होण्याचा धोका जास्त असल्याने या भागात पीसीआर अभिकर्मक आणि काढलेले न्यूक्लिक अॅसिड हाताळले जाऊ नये. या भागात हातमोजे, लॅब कोट, प्लेट आणि ट्यूब रॅक, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, बिन आणि इतर उपकरणांचा वेगळा संच असावा. नळ्या उघडण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज केल्या पाहिजेत. नमुना कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्स जागेप्रमाणेच स्वच्छ केले पाहिजे.
पीसीआर नंतर: उत्पादन विश्लेषण
ही खोली उत्पादन शोध उपकरणांसाठी आहे, उदा. जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस टँक, पॉवर पॅक, यूव्ही ट्रान्सिल्युमिनेटर आणि जेल डॉक्युमेंटेशन सिस्टम. या भागात हातमोजे, लॅब कोट, प्लेट आणि ट्यूब रॅक, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, बिन आणि इतर उपकरणांचे वेगळे संच असावेत. लोडिंग डाई, मॉलिक्युलर मार्कर आणि अॅगारोज जेल आणि बफर घटक वगळता इतर कोणतेही अभिकर्मक या भागात आणता येणार नाहीत. नमुना कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्स जागेप्रमाणेच स्वच्छ केले पाहिजे.
महत्वाची टीप
आदर्शपणे, जर पीसीआर नंतरच्या खोल्यांमध्ये काम आधीच केले गेले असेल तर त्याच दिवशी प्री-पीसीआर खोल्यांमध्ये प्रवेश करू नये. जर हे पूर्णपणे अपरिहार्य असेल तर, प्रथम हात पूर्णपणे धुवावेत आणि खोल्यांमध्ये विशिष्ट लॅब कोट घालावेत याची खात्री करा. जर पीसीआर नंतरच्या खोल्यांमध्ये लॅब पुस्तके आणि कागदपत्रे वापरली गेली असतील तर ती प्री-पीसीआर खोल्यांमध्ये नेऊ नयेत; आवश्यक असल्यास, प्रोटोकॉल/नमुना आयडी इत्यादींचे डुप्लिकेट प्रिंट-आउट घ्या.
४. सामान्य आण्विक जीवशास्त्र सल्ला
परख प्रतिबंध टाळण्यासाठी पावडर-मुक्त हातमोजे वापरा. दूषितता कमी करण्यासाठी योग्य पाईपेटिंग तंत्र अत्यंत महत्त्वाचे आहे. चुकीच्या पाईपेटिंगमुळे द्रवपदार्थ वितरित करताना स्प्लॅशिंग होऊ शकते आणि एरोसोल तयार होऊ शकतात. योग्य पाईपेटिंगसाठी चांगल्या पद्धती खालील लिंक्सवर आढळू शकतात: गिलसन पाईपेटिंगसाठी मार्गदर्शक, अॅनाकेम पाईपेटिंग तंत्र व्हिडिओ, उघडण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब आणि स्प्लॅशिंग टाळण्यासाठी त्या काळजीपूर्वक उघडा. दूषित पदार्थांचा प्रवेश टाळण्यासाठी वापरल्यानंतर लगेच नळ्या बंद करा.
अनेक अभिक्रिया करताना, अभिकर्मकांच्या हस्तांतरणाची संख्या कमी करण्यासाठी आणि दूषित होण्याचा धोका कमी करण्यासाठी सामान्य अभिकर्मक (उदा. पाणी, dNTP, बफर, प्रायमर आणि एन्झाइम) असलेले एक मास्टरमिक्स तयार करा. मास्टरमिक्स बर्फावर किंवा कोल्ड ब्लॉकवर सेट करण्याची शिफारस केली जाते. हॉट स्टार्ट एन्झाइमचा वापर विशिष्ट नसलेल्या उत्पादनांचे उत्पादन कमी करण्यास मदत करू शकतो. क्षय टाळण्यासाठी फ्लोरोसेंट प्रोब असलेल्या अभिकर्मकांना प्रकाशापासून संरक्षण द्या.
५. अंतर्गत नियंत्रणे
सर्व अभिक्रियांमध्ये टेम्पलेट नसलेले नियंत्रण आणि परिमाणात्मक अभिक्रियांसाठी बहु-बिंदू टायट्रेटेड ट्रेंडलाइनसह सु-वैशिष्ट्यीकृत, पुष्टी केलेली सकारात्मक आणि नकारात्मक नियंत्रणे समाविष्ट करा. सकारात्मक नियंत्रण इतके मजबूत नसावे की ते दूषित होण्याचा धोका निर्माण करेल. न्यूक्लिक अॅसिड निष्कर्षण करताना सकारात्मक आणि नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रणे समाविष्ट करा.
वापरकर्त्यांना आचारसंहितेची जाणीव व्हावी म्हणून प्रत्येक क्षेत्रात स्पष्ट सूचना पोस्ट करण्याची शिफारस केली जाते. क्लिनिकल नमुन्यांमध्ये डीएनए किंवा आरएनएची पातळी खूप कमी आढळणाऱ्या निदान प्रयोगशाळांना पीसीआरपूर्व खोल्यांमध्ये किंचित सकारात्मक हवेचा दाब आणि पीसीआरनंतरच्या खोल्यांमध्ये किंचित नकारात्मक हवेचा दाब असलेली स्वतंत्र हवा हाताळणी प्रणाली असण्याचा अतिरिक्त सुरक्षा उपाय स्वीकारावा लागू शकतो.
शेवटी, गुणवत्ता हमी (QA) योजना विकसित करणे उपयुक्त आहे. अशा योजनेत अभिकर्मक मास्टर स्टॉक आणि कार्यरत स्टॉकची यादी, किट आणि अभिकर्मक साठवण्याचे नियम, नियंत्रण निकालांचा अहवाल देणे, कर्मचारी प्रशिक्षण कार्यक्रम, समस्यानिवारण अल्गोरिदम आणि आवश्यकतेनुसार उपचारात्मक कृती यांचा समावेश असावा.
६. ग्रंथसूची
अस्लान ए, किंजेलमन जे, ड्रीलिन ई, अनानेवा टी, लव्हेंडर जे. प्रकरण ३: क्यूपीसीआर प्रयोगशाळेची स्थापना. यूएसईपीए क्यूपीसीआर पद्धत १६११ वापरून मनोरंजनात्मक पाण्याची चाचणी करण्यासाठी मार्गदर्शक दस्तऐवज. लान्सिंग- मिशिगन स्टेट युनिव्हर्सिटी.
पब्लिक हेल्थ इंग्लंड, एनएचएस. मायक्रोबायोलॉजी तपासणीसाठी यूके मानके: आण्विक प्रवर्धन चाचण्या करताना चांगले प्रयोगशाळा सराव). गुणवत्ता मार्गदर्शन. २०१३;४(४):१–१५.
मिफ्लिन टी. पीसीआर प्रयोगशाळेची स्थापना. कोल्ड स्प्रिंग हार्ब प्रोटोकॉल. २००७;७.
श्रोडर एस २०१३. सेंट्रीफ्यूजची नियमित देखभाल: सेंट्रीफ्यूज, रोटर्स आणि अडॅप्टरची स्वच्छता, देखभाल आणि निर्जंतुकीकरण (श्वेतपत्र क्रमांक १४). हॅम्बुर्ग: एपेनडॉर्फ; २०१३.
व्हियाना आरव्ही, वॉलिस सीएल. डायग्नोस्टिक प्रयोगशाळांमध्ये वापरल्या जाणाऱ्या आण्विक आधारित चाचण्यांसाठी गुड क्लिनिकल लॅबोरेटरी प्रॅक्टिस (जीसीएलपी), इन: अक्यार आय, संपादक. गुणवत्ता नियंत्रणाचा विस्तृत स्पेक्ट्रा. रिजेका, क्रोएशिया: इंटेक; २०११: २९–५२.
पोस्ट वेळ: जुलै-१६-२०२०
