Rêbazên tespîtkirina molekulî xwedî şiyana hilberandina hejmareke mezin ji asîda nukleîk in bi rêya zêdekirina mîqdarên şopê yên di nimûneyan de. Her çend ev ji bo çalakkirina tespîtkirina hesas sûdmend be jî, ew di heman demê de îhtîmala kontaminasyonê bi rêya belavbûna aerosolên zêdekirinê di hawîrdora laboratûvarê de jî derdixe holê. Dema ku ceribandin têne kirin, tedbîr dikarin werin girtin da ku ji kontaminasyona reagentan, alavên laboratûvarê û cîhê kursiyê dûr bikevin, ji ber ku kontaminasyoneke wisa dikare encamên erênî yên derewîn (an neyînî yên derewîn) çêbike.
Ji bo kêmkirina îhtîmala gemarbûnê, divê her dem Pratîka Laboratîfê ya Baş were bicîhanîn. Bi taybetî, divê tedbîr di derbarê xalên jêrîn de werin girtin:
1. Destwerdana reagentan
2. Rêxistinkirina qada kar û amûran
3. Şîretên bikaranîn û paqijkirinê ji bo qada molekulî ya diyarkirî
4. Şîretên giştî yên biyolojiya molekulî
5. Kontrolên navxweyî
6. Pirtûknasî
1. Destwerdana reagentan
Ji bo rêgirtina li çêbûna aerosolan, berî vekirinê lûleyên reagentan bi kurtasî santrifuj bikin. Ji bo rêgirtina li cemidandin-helandina pirjimar û qirêjbûna stokên sereke, reagentan bi awayekî zelal bikar bînin. Hemî lûleyên reagent û reaksiyonê bi zelalî etîket bikin û dîrok bikin û tomarên hejmarên lot û koma reagentan ên ku di hemî ceribandinan de hatine bikar anîn biparêzin. Hemî reagent û nimûneyan bi karanîna serê fîlterê bi pîpetê ve girêdin. Berî kirînê, tê pêşniyar kirin ku hûn bi hilberîner re piştrast bikin ku serê fîlterê li gorî marqeya pîpeta ku dê were bikar anîn in.
2. Rêxistinkirina qada kar û amûran
Divê cîhê kar bi awayekî were organîzekirin ku herikîna kar di yek alî de, ji deverên paqij (berî PCR) ber bi deverên qirêj (piştî PCR) ve, pêk were. Tedbîrên giştî yên jêrîn dê bibin alîkar ku şansê qirêjbûnê kêm bibe. Ji bo van tiştan, odeyên cuda yên taybet, an jî herî kêm deverên ji hev cuda yên fîzîkî hebin: amadekirina tevliheviya sereke, derxistina asîda nukleîk û lêzêdekirina şablona DNA, zêdekirin û destwerdana berhema zêdekirî, û analîzkirina berhemê, mînak elektroforeza jel.
Li hin deveran, hebûna 4 odeyên cuda dijwar e. Vebijarkek gengaz lê kêmtir xwestî ew e ku amadekirina tevliheviya sereke di qadeke parastinê de were kirin, mînak kabîneya herikîna laminar. Di rewşa amplîfîkasyona PCR ya nested de, amadekirina tevliheviya sereke ji bo reaksiyona dora duyemîn divê di qada 'paqij' de ji bo amadekirina tevliheviya sereke were amadekirin, lê derzîkirina bi berhema PCR ya sereke divê di odeya amplîfîkasyonê de were kirin, û heke gengaz be di qadeke parastinê ya taybetî de (mînak kabîneya herikîna laminar).
Her ode/qadek pêdivî bi komek cuda ji pîpetên bi nîşanek zelal, serê fîlteran, refikên lûleyan, vorteks, santrifûj (eger pêwîst be), pênûs, reagentên laboratîfê yên gelemperî, kincên laboratîfê û qutiyên lepikan heye ku dê li stasyonên xebatê yên têkildar bimînin. Dema ku di navbera deverên diyarkirî de diçin û tên, divê dest werin şuştin û lepik û kincên laboratîfê werin guhertin. Divê reagent û amûr ji qadeke qirêj neyên veguhastin qadeke paqij. Ger rewşek giran derkeve holê ku reagentek an perçeyek amûrek hewce bike ku bi paş ve were veguhastin, divê ew pêşî bi sodyûm hîpoklorîta %10 were dezenfektekirin, dûv re bi ava sterîl were paqijkirin.
Not
Divê çareseriya sodyûm hîpoklorît a %10 rojane nû were amadekirin. Dema ku ji bo dekontaminasyonê tê bikar anîn, divê herî kêm 10 hûrdem dema têkiliyê were şopandin.
Bi awayekî din, heke pêşniyarên ewlehiyê yên herêmî destûrê nedin karanîna sodyûm hîpoklorît an jî heke sodyûm hîpoklorît ji bo dekontaminasyona beşên metalî yên alavan ne guncaw be, hilberên ku bi bazirganî hene û wekî dekontaminantên rûberê yên ku DNA-yê hilweşînin hatine pejirandin, dikarin werin bikar anîn.
Bi awayekî îdeal, divê karmend pabendî rêgeza herikîna kar a yekalî bin û di heman rojê de ji deverên qirêj (piştî PCR) venegerin deverên paqij (berî PCR). Lêbelê, dibe ku hin rewş hebin ku ev yek neçar be. Dema ku rewşek wisa çêdibe, divê karmend baldar bin ku destên xwe bi tevahî bişon, lepikan biguherînin, kincê laboratîfê yê diyarkirî bikar bînin û careke din ti alavên ku ew dixwazin ji odeyê derxînin, wekî pirtûkên laboratîfê, neynin. Divê tedbîrên kontrolê yên weha di perwerdehiya karmendan de li ser rêbazên molekulî werin tekez kirin.
Piştî bikaranînê, divê cîhên kursiyan bi sodyûm hîpoklorîta %10 (paşê bi ava sterîl ji bo rakirina spîkerê mayî), %70 etanol, an dekontaminantek DNA-yê ya bazirganî ya pejirandî were paqijkirin. Bi awayekî îdeal, divê çirayên ultraviyole (UV) werin saz kirin da ku dekontaminasyona bi tîrêjê gengaz bikin. Lêbelê, divê karanîna çirayên UV bi deverên xebatê yên girtî, mînakî kabîneyên ewlehiyê, were sînordar kirin da ku rûbirûbûna karmendên laboratûarê bi tîrêjên UV re sînordar bibe. Ji kerema xwe rêwerzên çêker ji bo lênêrîna çirayên UV, hewakirin û paqijkirinê bişopînin da ku piştrast bibin ku çira bi bandor dimînin.
Eger li şûna sodyûm hîpoklorît %70 etanol were bikaranîn, ji bo temamkirina dekontaminasyonê pêdivî bi tîrêjên ultraviyole heye.
Girêk û santrifûjê bi sodyûm hîpoklorît paqij nekin; li şûna wê, bi %70 etanol paqij bikin û di bin tîrêjên UV de bihêlin, an jî dekontaminantek bazirganî ya ku DNA-yê hilweşîne bikar bînin. Ji bo rijandinê, ji bo şîretên paqijkirinê yên bêtir bi hilberîner re şêwir bikin. Ger rêwerzên hilberîner destûrê bidin, divê pîpet bi rêkûpêk bi otoklavê werin sterîl kirin. Ger pîpet nikaribin werin otoklav kirin, divê paqijkirina wan bi %10 sodyûm hîpoklorît (paşê bi ava sterîl bi tevahî were paqij kirin) an jî bi dekontaminantek bazirganî ya ku DNA-yê hilweşîne û dûv re jî di bin tîrêjên UV de were kirin bes be.
Paqijkirina bi sodyûm hîpoklorîta rêjeyek bilind, heke bi rêkûpêk were kirin, dibe ku zirarê bide plastîk û metalên pîpetan; pêşî pêşniyarên ji hilberîner kontrol bikin. Pêdivî ye ku hemî alav li gorî bernameya pêşniyarkirî ya hilberîner bi rêkûpêk werin kalibr kirin. Divê kesek diyarkirî berpirsiyar be ku piştrast bike ku bernameya kalibrkirinê tê şopandin, tomarên berfireh têne parastin, û etîketên xizmetê bi zelalî li ser alavan têne xuyang kirin.
3. Şîretên bikaranîn û paqijkirinê ji bo qada molekulî ya diyarkirî
Pêş-PCR: Dabeşkirina reaktîfan / amadekirina tevliheviya sereke: Divê ev cih ji hemû cihên ku ji bo amadekirina ceribandinên molekulî têne bikar anîn paqijtirîn be û bi îdeal divê kabîneyek herikîna lamînar a diyarkirî be ku bi ronahiyek UV ve hatî sazkirin. Nimûne, asîda nukleîk a derxistî û berhemên PCR-ê yên zêdekirî divê li vê deverê neyên destgirtin. Reaktîfên zêdekirinê divê di heman cîhê diyarkirî de di sarincokê de (an jî sarincokê, li gorî pêşniyarên hilberîner) werin hilanîn, bi îdeal li kêleka kabîneya herikîna lamînar an jî qada pêş-PCR. Divê her carê ku hûn dikevin qada pêş-PCR an jî kabîneya herikîna lamînar, lepik werin guhertin.
Divê qada pêş-PCR an kabîneya herikîna laminar berî û piştî bikaranînê wiha were paqijkirin: Hemû tiştên di kabîneyê de, mînak pîpet, qutiyên serî, vorteks, santrifûj, refikên lûleyan, pênûs û hwd., bi etanolê %70 an dekontaminantek bazirganî ya ku DNA-yê hilweşîne, paqij bikin û bihêlin hişk bibe. Di rewşa qadeke xebatê ya girtî de, mînak kabîneya herikîna laminar, kapûtê 30 deqîqeyan li ber ronahiya UV bidin.
Not
Reagentan nexin ber tîrêjên UV; tenê piştî ku kabîne paqij bû, wan bixin nav kabîneyê. Ger hûn PCR-ya transkrîpsiyona berevajî pêk tînin, dibe ku kêrhatî be ku rûber û amûran bi çareseriyek ku RNazan di têkiliyê de hilweşîne paqij bikin. Ev dikare bibe alîkar ku ji encamên neyînî yên derewîn ên ji hilweşîna enzîmê ya RNA-yê dûr bikevin. Piştî dekontaminasyonê û berî amadekirina tevliheviya sereke, divê destan careke din werin guhertin, û wê hingê kabîne amade ye ku were bikar anîn.
Pêş-PCR: Derxistina asîda nukleîk/lêzêdekirina şablonê:
Divê asîda nukleîk li deverek duyemîn a diyarkirî were derxistin û destgirtin, bi karanîna komek pîpet, serê fîlteran, refikên lûleyan, lepikên nû, cilên laboratîfê û alavên din ên cuda. Ev dever di heman demê de ji bo zêdekirina şablon, kontrol û xetên trendê li lûle an plakayên tevliheviya master e. Ji bo pêşîgirtina li qirêjbûna nimûneyên asîda nukleîk ên derxistî yên ku têne analîzkirin, tê pêşniyar kirin ku berî destgirtina bi kontrolên erênî an standardan lepik werin guhertin û komek pîpetên cuda werin bikar anîn. Reaktantên PCR û hilberên zêdekirî divê li vê deverê neyên pîpetkirin. Divê nimûne di sarinc an cemidankên diyarkirî de li heman deverê werin hilanîn. Cihê xebata nimûneyê divê bi heman awayî wekî cîhê tevliheviya master were paqij kirin.
Piştî-PCR: Zêdekirin û destwerdana berhema zêdekirî
Ev cîhê taybet ji bo pêvajoyên piştî-amplîfîkasyonê ye û divê ji deverên berî-PCR-ê bi awayekî fîzîkî cuda be. Bi gelemperî, ew termocyclers û platformên rast-dem dihewîne, û bi îdeal divê kabîneyek herikîna laminar hebe ji bo zêdekirina berhema PCR-ê ya dora 1-ê li reaksiyona dora 2-ê, heke PCR-ya nested tê kirin. Reagentên PCR û asîda nukleîk a derxistî divê di vê deverê de neyên destgirtin ji ber ku xetera qirêjbûnê zêde ye. Divê ev dever komek lepik, kincên laboratîfê, refikên plaka û lûleyan, pîpet, serê fîlteran, qutî û alavên din ên cuda hebin. Divê lûle berî vekirinê werin santrifujkirin. Cihê xebata nimûneyê divê bi heman awayî wekî cîhê mastermix were paqij kirin.
Piştî-PCR: Analîza hilberê
Ev ode ji bo alavên tespîtkirina berheman e, mînak tankên elektroforeza jel, pakêtên hêzê, transîlumînatora UV û pergala belgekirina jel. Divê di vê qadê de setên lepikan, cilên laboratîfê, refikên plaka û lûleyan, pîpet, serê fîlteran, qutî û alavên din ên cuda hebin. Ji bilî boyaxa barkirinê, nîşankera molekulî û jela agarozê, û pêkhateyên tamponê, tu reagentên din nayên anîn vê qadê. Cihê xebata nimûneyê divê bi heman awayî wekî cîhê tevliheviya master were paqij kirin.
Têbînîyeke girîng
Bi awayekî îdeal, heke berê di odeyên piştî PCR de xebat hatibe kirin, divê di heman rojê de nekevin odeyên pêş-PCR. Ger ev bi tevahî neçar be, pê ewle bin ku dest pêşî bi tevahî werin şuştin û cilên taybetî yên laboratîfê di odeyan de werin lixwekirin. Pirtûk û kaxezên laboratîfê divê neyên birin odeyên pêş-PCR ger ew di odeyên piştî PCR de hatibin bikar anîn; heke pêwîst be, çapên dubare yên protokol/nasnameyên nimûneyan, hwd. bigirin.
4. Şîretên giştî yên biyolojiya molekulî
Ji bo rêgirtina li astengkirina ceribandinê, lepikên bê toz bikar bînin. Teknîka pîpetkirinê ya rast ji bo kêmkirina qirêjbûnê pir girîng e. Pîpetkirina xelet dikare bibe sedema rijandina avê dema belavkirina şilekan û çêbûna aerosolan. Pratîkên baş ji bo pîpetkirina rast li lînkên jêrîn têne dîtin: Rêbernameya Gilson ji bo pîpetkirinê, vîdyoyên teknîka pîpetkirinê ya Anachem, Berî vekirinê lûleyên santrifûjê bikin, û wan bi baldarî vekin da ku ji rijandinê dûr bikevin. Piştî karanînê tavilê lûleyan bigirin da ku ji ketina qirêjiyan dûr bikevin.
Dema ku gelek reaksiyonan pêk tînin, ji bo kêmkirina hejmara veguhestina reaktîfan û kêmkirina metirsiya qirêjbûnê, yek mastermix amade bikin ku reaktîfên hevpar (mînak av, dNTP, tampon, primer û enzîm) tê de hebin. Tête pêşniyar kirin ku mastermix li ser qeşayê an blokek sar were danîn. Bikaranîna enzîmek Destpêka Germ dikare bibe alîkar ku hilberîna hilberên ne-taybetî kêm bike. Ji bo rêgirtina li hilweşînê, reaktîfên ku probên floresan tê de hene ji ronahiyê biparêzin.
5. Kontrolên navxweyî
Kontrolên erênî û neyînî yên baş-taybetmendî û piştrastkirî, digel kontrolek bê-şablon di hemî reaksiyonan de, û xêzek trendê ya tîtrîkirî ya pir-xalî ji bo reaksiyonên hejmarî têxin nav xwe. Divê kontrola erênî ewqas bihêz nebe ku xetera kontaminasyonê çêbike. Dema ku derxistina asîda nukleîk tê kirin, kontrolên derxistina erênî û neyînî têxin nav xwe.
Pêşniyar tê kirin ku rêwerzên zelal li her deverê werin daliqandin da ku bikarhêner ji qaîdeyên tevgerê haydar bin. Laboratuarên teşhîsê yên ku astên pir kêm ên DNA an RNA di nimûneyên klînîkî de tespît dikin, dibe ku bixwazin tedbîra ewlehiyê ya zêde ya hebûna pergalên hilgirtina hewayê yên cuda bi zexta hewayê ya hinekî erênî di odeyên berî PCR û zexta hewayê ya hinekî neyînî di odeyên piştî PCR de bigirin.
Di dawiyê de, pêşxistina planeke piştrastkirina kalîteyê (QA) alîkar e. Planeke wisa divê navnîşên stokên sereke yên reagentan û stokên xebatê, rêziknameyên ji bo hilanîna kît û reagentan, ragihandina encamên kontrolê, bernameyên perwerdehiya karmendan, algorîtmayên çareserkirina pirsgirêkan, û tedbîrên çareseriyê dema ku pêwîst be, di nav xwe de bigire.
6. Pirtûknasî
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Beşa 3: Sazkirina laboratuwarek qPCR. Belgeyek rêbernameyê ji bo ceribandina avên rekreasyonê bi karanîna rêbaza qPCR ya USEPA 1611. Zanîngeha Dewleta Lansing- Michigan.
Tenduristiya Giştî ya Îngilîstanê, NHS. Standardên Keyaniya Yekbûyî ji bo lêkolînên mîkrobiolojiyê: Pratîka Laboratîfê ya Baş dema ku ceribandinên zêdekirina molekulî pêk tên). Rêbernameya Kalîteyê. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Avakirina laboratuwareke PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Parastina rûtîn a santrifûjan: paqijkirin, parastin û dezenfektekirina santrifûjan, rotoran û adapteran (Kaxeza Spî Hejmar 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Pratîka Laboratuwara Klînîkî ya Baş (GCLP) ji bo testên li ser bingeha molekulî yên ku di laboratuwarên teşhîsê de têne bikar anîn, Di: Akyar I, edîtor. Spektrên fireh ên kontrola kalîteyê. Rijeka, Kroatya: Intech; 2011: 29–52.
Dema weşandinê: 16ê Tîrmehê-2020
