מה לעשות ומה לא לעשות בבדיקות מולקולריות

לשיטות גילוי מולקולריות יש את היכולת לייצר כמות גדולה של חומצות גרעין באמצעות הגברה של כמויות זעירות הנמצאות בדגימות. אמנם זה מועיל לאפשר גילוי רגיש, זה גם מעלה את האפשרות של זיהום באמצעות פיזור אירוסולי הגברה בסביבת המעבדה. בעת ביצוע ניסויים, ניתן לנקוט באמצעים כדי למנוע זיהום של ריאגנטים, ציוד מעבדה וחלל מעבדה, שכן זיהום כזה עלול לייצר תוצאות חיוביות שגויות (או שליליות שגויות).

כדי לסייע בהפחתת הסבירות לזיהום, יש לנקוט בכל עת בשיטות מעבדה נאותות. באופן ספציפי, יש לנקוט באמצעי זהירות בנוגע לנקודות הבאות:

1. טיפול בריאגנטים
2. ארגון סביבת העבודה והציוד
3. הוראות שימוש וניקוי עבור המרחב המולקולרי המיועד
4. ייעוץ כללי לביולוגיה מולקולרית
5. בקרות פנימיות
6. ביבליוגרפיה

1. טיפול בריאגנטים

יש לצנטריפוגה קצרה של מבחנות הריאגנטים לפני הפתיחה כדי למנוע יצירת אירוסולים. יש לחלק את הריאגנטים כדי למנוע הקפאה והפשרה מרובים וזיהום של חומרי הגלם. יש לתייג ולתארך בבירור את כל מבחנות הריאגנטים והתגובה ולנהל יומן של מספרי האצווה והאצווה של הריאגנטים ששימשו בכל הניסויים. יש לבצע פיפטה של ​​כל הריאגנטים והדגימות באמצעות קצוות הסינון. לפני הרכישה, מומלץ לוודא עם היצרן שקצוות הסינון מתאימים למותג הפיפטה המיועד לשימוש.

2. ארגון סביבת העבודה והציוד

יש לארגן את סביבת העבודה כך שתהליך העבודה יתבצע בכיוון אחד, מאזורים נקיים (לפני PCR) לאזורים מלוכלכים (לאחר PCR). אמצעי הזהירות הכלליים הבאים יסייעו בהפחתת הסיכוי לזיהום. יש להקפיד על חדרים ייעודיים נפרדים, או לפחות אזורים נפרדים פיזית, עבור: הכנת מאסטרמיקס, מיצוי חומצות גרעין והוספת תבנית DNA, הגברה וטיפול בתוצר המוגבר, וניתוח תוצר, למשל אלקטרופורזה בג'ל.

במקומות מסוימים, קשה להחזיק ב-4 חדרים נפרדים. אפשרות אפשרית אך פחות רצויה היא לבצע את הכנת המאסטרמיקס באזור בלימה, למשל ארון זרימה למינרית. במקרה של הגברת PCR מקוננת, יש להכין את המאסטרמיקס לתגובת הסיבוב השני באזור ה"נקי" להכנת המאסטרמיקס, אך את ההזרקה עם תוצר ה-PCR הראשוני יש לבצע בחדר ההגברה, ואם אפשר באזור בלימה ייעודי (למשל ארון זרימה למינרית).

כל חדר/אזור זקוק לסט נפרד של פיפטות, קצוות סינון, מתלים למבחנים, מערבולים, צנטריפוגות (אם רלוונטי), עטים, ריאגנטים גנריים למעבדה, חלוקי מעבדה וקופסאות כפפות שיישארו בתחנות העבודה המתאימות. יש לשטוף ידיים ולהחליף כפפות וחלוקי מעבדה בעת מעבר בין האזורים המיועדים. אין להעביר ריאגנטים וציוד מאזור מלוכלך לאזור נקי. במקרה של מקרה קיצוני בו יש להזיז ריאגנט או פריט ציוד אחורה, יש לחטא אותם תחילה עם נתרן היפוכלוריט 10%, ולאחר מכן לנגב אותם במים סטריליים.

פֶּתֶק

יש להכין תמיסת נתרן היפוכלוריט 10% טרייה מדי יום. בעת שימוש לצורך חיטוי, יש להקפיד על זמן מגע מינימלי של 10 דקות.
לחלופין, ניתן להשתמש במוצרים זמינים מסחרית המאושרים כחומרי ניקוי משטחים להרס DNA אם המלצות הבטיחות המקומיות אינן מתירות שימוש בנתרן היפוכלוריט או אם נתרן היפוכלוריט אינו מתאים לחיטוי החלקים המתכתיים של הציוד.

באופן אידיאלי, על הצוות לדבוק באתוס של זרימת עבודה חד-כיוונית ולא לחזור מאזורים מלוכלכים (לאחר PCR) לאזורים נקיים (לפני PCR) באותו היום. עם זאת, ייתכנו מקרים בהם הדבר בלתי נמנע. כאשר מתרחש מקרה כזה, על הצוות לדאוג לשטיפה יסודית של ידיים, החלפת כפפות, שימוש בחלוק המעבדה המיועד ולא הכנסת ציוד שירצו להוציא שוב מהחדר, כגון ספרי מעבדה. יש להדגיש אמצעי בקרה כאלה בהכשרת הצוות בשיטות מולקולריות.

לאחר השימוש, יש לנקות את חללי המעבדה באמצעות נתרן תת-כלורי 10% (ולאחר מכן מים סטריליים להסרת שאריות אקונומיקה), אתנול 70%, או חומר ניקוי מסחרי מאומת להרס DNA. באופן אידיאלי, יש להתקין מנורות אולטרה סגולות (UV) כדי לאפשר ניקוי באמצעות הקרנה. עם זאת, יש להגביל את השימוש במנורות UV לאזורי עבודה סגורים, למשל ארונות בטיחות, על מנת להגביל את החשיפה של צוות המעבדה לקרינת UV. יש להקפיד על הוראות היצרן לטיפול במנורת UV, אוורור וניקוי על מנת להבטיח שהמנורות יישארו יעילות.

אם משתמשים באתנול 70% במקום נתרן תת-כלורי, יהיה צורך בקרינה באור UV כדי להשלים את תהליך החיטוי.
אין לנקות את המערבולת והצנטריפוגה עם נתרן תת-כלורי; במקום זאת, יש לנגב עם אתנול 70% ולחשוף לאור UV, או להשתמש בחומר ניקוי מסחרי להרס DNA. במקרה של נזילות, יש לפנות ליצרן לקבלת עצות ניקוי נוספות. אם הוראות היצרן מאפשרות זאת, יש לעקר פיפטות באופן שגרתי באמצעות אוטוקלאב. אם לא ניתן לחטא פיפטות באוטוקלאב, ניקוין עם נתרן תת-כלורי 10% אמור להספיק (ולאחר מכן ניגוב יסודי במים סטריליים) או עם חומר ניקוי מסחרי להרס DNA ולאחר מכן חשיפה לקרינת UV.

ניקוי עם נתרן תת-כלורי באחוז גבוה עלול בסופו של דבר לפגוע בפלסטיק ובמתכות של פיפטות אם נעשה באופן קבוע; יש לבדוק תחילה את המלצות היצרן. יש לכייל את כל הציוד באופן קבוע בהתאם ללוח הזמנים המומלץ על ידי היצרן. אדם ייעודי צריך להיות אחראי על הקפדה על לוח הזמנים של הכיול, ניהול יומנים מפורטים ותוויות שירות מוצגות בבירור על הציוד.

3. הוראות שימוש וניקוי עבור המרחב המולקולרי המיועד

קדם-PCR: חלוקת ריאגנטים / הכנת מאסטרמיקס: זהו החלל הנקי ביותר המשמש להכנת ניסויים מולקולריים, ובאופן אידיאלי צריך להיות ארון זרימה למינרית ייעודי המצויד בקרן UV. אין לטפל בדגימות, חומצות גרעין שחולצו ותוצרי PCR מוגברים באזור זה. יש לשמור ריאגנטים להגברה במקפיא (או במקרר, בהתאם להמלצות היצרן) באותו חלל ייעודי, רצוי ליד ארון הזרימה הלמינרית או אזור קדם-PCR. יש להחליף כפפות בכל פעם שנכנסים לאזור קדם-PCR או לארון הזרימה הלמינרית.

יש לנקות את אזור טרום-PCR או את ארון הזרימה הלמינרית לפני ואחרי השימוש באופן הבא: נגבו את כל הפריטים בארון, למשל פיפטות, קופסאות טיפים, מערבולת, צנטריפוגה, מתלים למבחנים, עטים וכו', עם אתנול 70% או חומר ניקוי מסחרי להרס DNA, והניחו להם להתייבש. במקרה של אזור עבודה סגור, למשל ארון זרימה למינרית, חשפו את מכסה המנוע לאור UV למשך 30 דקות.

פֶּתֶק

אין לחשוף ריאגנטים לאור UV; יש להעביר אותם לארון רק לאחר שהוא נקי. אם מבצעים PCR של שעתוק הפוך, ייתכן שיהיה כדאי גם לנגב משטחים וציוד עם תמיסה המפרקת RNases במגע. זה עשוי לסייע במניעת תוצאות שליליות שגויות כתוצאה מפירוק אנזימים של RNA. לאחר הניקוי ולפני הכנת המאסטרמיקס, יש להחליף כפפות שוב, ולאחר מכן הארון מוכן לשימוש.

קדם-PCR: מיצוי חומצות גרעין/הוספת תבנית:

יש לחלץ ולטפל בחומצה גרעין באזור ייעודי שני, באמצעות סט נפרד של פיפטות, קצוות סינון, מתלים למבחנים, כפפות נקיות, חלוקי מעבדה וציוד אחר. אזור זה מיועד גם להוספת תבנית, בקרות וקווי מגמה למבחנים או לצלחות של מאסטרמיקס. כדי למנוע זיהום של דגימות חומצות הגרעין שחולצו ועוברות ניתוח, מומלץ להחליף כפפות לפני הטיפול בבקרות חיוביות או בסטנדרטים ולהשתמש בסט נפרד של פיפטות. אין לטפטף ריאגנטים של PCR ותוצרים מוגברים באזור זה. יש לאחסן דגימות במקררים או מקפיאים ייעודיים באותו אזור. יש לנקות את סביבת העבודה של הדגימות באותו אופן כמו חלל המאסטרמיקס.

לאחר PCR: הגברה וטיפול בתוצר המוגבר

חלל ייעודי זה מיועד לתהליכים לאחר הגברה ועליו להיות נפרד פיזית מאזורי טרום-PCR. בדרך כלל הוא מכיל תרמו-ציקלרים ופלטפורמות בזמן אמת, ובאופן אידיאלי צריך להיות בו ארון זרימה למינרית להוספת תוצר ה-PCR מסבב 1 לתגובת סבב 2, אם מתבצע PCR מקונן. אין לטפל בריאגנטים של PCR וחומצות גרעין שחולצו באזור זה מכיוון שהסיכון לזיהום גבוה. באזור זה צריך להיות סט נפרד של כפפות, חלוקי מעבדה, מתלים לצלחות ולמבחנות, פיפטות, קצוות סינון, מיכלים וציוד אחר. יש לצנטריפוגה של המבחנות לפני הפתיחה. יש לנקות את סביבת העבודה של הדגימות באותו אופן כמו חלל המאסטרמיקס.

ניתוח מוצר לאחר PCR

חדר זה מיועד לציוד לגילוי מוצרים, לדוגמה, מיכלי אלקטרופורזה בג'ל, מארזי מתח, תאורת UV ומערכת תיעוד ג'ל. באזור זה צריכים להיות סטים נפרדים של כפפות, חלוקי מעבדה, מתלים לצלחות ולמבחניות, פיפטות, קצוות סינון, מיכלי אחסון וציוד אחר. אין להכניס ריאגנטים אחרים לאזור זה, למעט צבע טעינה, סמן מולקולרי וג'ל אגרוז, ורכיבי בופר. יש לנקות את סביבת העבודה של הדגימה באותו אופן כמו חלל המאסטרמיקס.

הערה חשובה

באופן אידיאלי, אין להיכנס לחדרי טרום-PCR באותו היום אם כבר בוצעה עבודה בחדרי פוסט-PCR. אם זה בלתי נמנע לחלוטין, יש לוודא שטיפת ידיים יסודית תחילה ולובשים חלוקי מעבדה ייעודיים בחדרים. אין להכניס ספרי מעבדה וניירת לחדרי טרום-PCR אם הם שימשו בחדרי פוסט-PCR; במידת הצורך, יש להדפיס כפילויות של פרוטוקולים/מזהי דגימות וכו'.

4. ייעוץ כללי לביולוגיה מולקולרית

השתמשו בכפפות ללא פודרה כדי למנוע עיכוב בבדיקה. טכניקת פיפטה נכונה היא קריטית להפחתת זיהום. פיפטה שגויה עלולה לגרום להתזות בעת מתן נוזלים וליצירת אירוסולים. שיטות עבודה מומלצות לפיפטה נכונה ניתן למצוא בקישורים הבאים: מדריך גילסון לפיפטה, סרטוני טכניקת פיפטה של ​​אנחם, צנטריפוגה של מבחנות לפני הפתיחה, ופתחו אותן בזהירות כדי למנוע התזות. סגרו את המבחנות מיד לאחר השימוש כדי למנוע החדרת מזהמים.

בעת ביצוע מספר תגובות, יש להכין אבתערובת אחת המכילה ריאגנטים נפוצים (למשל מים, dNTPs, בופר, פריימרים ואנזים) כדי למזער את מספר העברות הריאגנטים ולהפחית את הסיכון לזיהום. מומלץ להניח את האבתערובת על קרח או בלוק קר. שימוש באנזים Hot Start עשוי לסייע בהפחתת ייצור של תוצרים לא ספציפיים. יש להגן על ריאגנטים המכילים גלאים פלואורסצנטיים מאור על מנת למנוע פירוק.

5. בקרות פנימיות

יש לכלול בקרות חיוביות ושליליות מאומתות ומאופיינות היטב, יחד עם בקרה ללא תבנית בכל התגובות, וקו מגמה טיטרטיבי רב-נקודות לתגובות כמותיות. הבקרה החיובית לא צריכה להיות חזקה כל כך שהיא מהווה סיכון לזיהום. יש לכלול בקרות מיצוי חיוביות ושליליות בעת ביצוע מיצוי חומצות גרעין.

מומלץ להציב הוראות ברורות בכל אחד מהאזורים כדי שהמשתמשים יהיו מודעים לכללי ההתנהגות. מעבדות אבחון המזהות רמות נמוכות מאוד של DNA או RNA בדגימות קליניות עשויות לרצות לאמץ את אמצעי האבטחה הנוסף של מערכות טיפול באוויר נפרדות עם לחץ אוויר חיובי קל בחדרי טרום-PCR ולחץ אוויר שלילי קל בחדרי פוסט-PCR.

לבסוף, פיתוח תוכנית אבטחת איכות (QA) מועיל. תוכנית כזו צריכה לכלול רשימות של מלאי ריאגנטים ראשי ומלאי עבודה, כללים לאחסון ערכות וריאגנטים, דיווח על תוצאות בקרה, תוכניות הכשרה לצוות, אלגוריתמים לפתרון בעיות ופעולות מתקנות בעת הצורך.

6. ביבליוגרפיה

אסלן א', קינזלמן י', דרילין א', אנאנ'בה ט', לבנדר י'. פרק 3: הקמת מעבדת qPCR. מסמך הנחיות לבדיקת מי פנאי באמצעות שיטת qPCR של USEPA 1611. לנסינג - אוניברסיטת מישיגן.

בריאות הציבור באנגליה, שירות הבריאות הלאומי (NHS). סטנדרטים בבריטניה לבדיקות מיקרוביולוגיה: נוהלי מעבדה נאותים בעת ביצוע מבחני הגברה מולקולרית). הנחיות איכות. 2013;4(4):1–15.

Mifflin T. הקמת מעבדת PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.

Schroeder S 2013. תחזוקה שוטפת של צנטריפוגות: ניקוי, תחזוקה וחיטוי של צנטריפוגות, רוטורים ומתאמים (מסמך לבן מס' 14). המבורג: אפנדורף; 2013.

ויאנה RV, וואליס CL. נוהלי מעבדה קליניים טובים (GCLP) לבדיקות מולקולריות המשמשות במעבדות אבחון, בתוך: אקיאר א', עורך. ספקטרום רחב של בקרת איכות. רייקה, קרואטיה: אינטק; 2011: 29–52.