Ինչ անել և ինչ չանել մոլեկուլային թեստավորման ժամանակ

Մոլեկուլային հայտնաբերման մեթոդները կարող են մեծ քանակությամբ նուկլեինաթթու արտադրել՝ նմուշներում հայտնաբերված հետքային քանակությունների ուժեղացման միջոցով: Չնայած սա օգտակար է զգայուն հայտնաբերման հնարավորություն տալու համար, այն նաև ներմուծում է աղտոտման հնարավորություն՝ լաբորատոր միջավայրում ուժեղացման աէրոզոլների տարածման միջոցով: Փորձարկումներ անցկացնելիս կարելի է միջոցներ ձեռնարկել՝ ռեակտիվների, լաբորատոր սարքավորումների և աշխատասենյակի աղտոտումը կանխելու համար, քանի որ նման աղտոտումը կարող է կեղծ դրական (կամ կեղծ բացասական) արդյունքներ առաջացնել:

Աղտոտման հավանականությունը նվազեցնելու համար միշտ պետք է կիրառվի լավ լաբորատոր պրակտիկա։ Մասնավորապես, նախազգուշական միջոցներ պետք է ձեռնարկվեն հետևյալ կետերի վերաբերյալ՝

1. Ռեակտիվների հետ վարվելակերպ
2. Աշխատանքային տարածքի և սարքավորումների կազմակերպում
3. Նշանակված մոլեկուլային տարածքի օգտագործման և մաքրման խորհուրդներ
4. Մոլեկուլային կենսաբանության ընդհանուր խորհրդատվություն
5. Ներքին վերահսկողություն
6. Մատենագրություն

1. Ռեակտիվների հետ վարվելակերպ

Բացելուց առաջ կարճատև ցենտրիֆուգացրեք ռեակտիվների խողովակները՝ աէրոզոլների առաջացումը կանխելու համար: Ալիքվոտե ռեակտիվները՝ բազմակի սառեցում-հալեցումից և հիմնական պաշարների աղտոտումից խուսափելու համար: Հստակորեն պիտակավորեք և ամսաթվագրեք բոլոր ռեակտիվների և ռեակցիայի խողովակները, ինչպես նաև պահպանեք բոլոր փորձերում օգտագործված ռեակտիվների խմբաքանակի և սերիայի համարների գրանցամատյանները: Բոլոր ռեակտիվներն ու նմուշները պիպետով լցրեք ֆիլտրի ծայրակալներով: Գնելուց առաջ խորհուրդ է տրվում արտադրողի հետ ճշտել, որ ֆիլտրի ծայրակալները համապատասխանում են օգտագործվող պիպետի ապրանքանիշին:

2. Աշխատանքային տարածքի և սարքավորումների կազմակերպում

Աշխատանքային տարածքը պետք է կազմակերպված լինի այնպես, որ աշխատանքի հոսքը տեղի ունենա մեկ ուղղությամբ՝ մաքուր տարածքներից (նախքան ՊՇՌ-ը) մինչև կեղտոտ տարածքներ (ՊՇՌ-ից հետո): Հետևյալ ընդհանուր նախազգուշական միջոցները կօգնեն նվազեցնել աղտոտման հավանականությունը: Ունեցեք առանձին նախատեսված սենյակներ կամ առնվազն ֆիզիկապես առանձնացված տարածքներ՝ մաստերխառնուրդի պատրաստման, նուկլեինաթթվի արդյունահանման և ԴՆԹ ձևանմուշի ավելացման, ամպլիֆիկացված արտադրանքի մշակմամբ և մշակմամբ, ինչպես նաև արտադրանքի վերլուծությամբ, օրինակ՝ գելային էլեկտրոֆորեզով:

Որոշ դեպքերում 4 առանձին սենյակ ունենալը դժվար է: Հնարավոր, բայց ոչ այնքան ցանկալի տարբերակ է գլխավոր խառնուրդի պատրաստումը կատարել փակ տարածքում, օրինակ՝ լամինար հոսքի պահարանում: Ներկառուցված ՊՇՌ ուժեղացման դեպքում, երկրորդ փուլի ռեակցիայի համար գլխավոր խառնուրդի պատրաստումը պետք է կատարվի գլխավոր խառնուրդի պատրաստման «մաքուր» տարածքում, բայց առաջնային ՊՇՌ արդյունքով պատվաստումը պետք է կատարվի ուժեղացման սենյակում, և եթե հնարավոր է, նաև հատուկ փակ տարածքում (օրինակ՝ լամինար հոսքի պահարան):

Յուրաքանչյուր սենյակ/տարածք պետք է ունենա հստակ նշված պիպետների, ֆիլտրի ծայրերի, խողովակների դարակների, մրրիկների, ցենտրիֆուգների (եթե կա), գրիչների, ընդհանուր լաբորատոր ռեակտիվների, լաբորատոր խալաթների և ձեռնոցների տուփերի առանձին հավաքածու, որոնք կմնան համապատասխան աշխատանքային կայաններում: Նշանակված տարածքների միջև տեղաշարժվելիս ձեռքերը պետք է լվանալ, իսկ ձեռնոցներն ու խալաթները փոխել: Ռեակտիվներն ու սարքավորումները չպետք է տեղափոխվեն կեղտոտ տարածքից մաքուր տարածք: Եթե ծայրահեղ դեպքում ռեակտիվը կամ սարքավորումը պետք է տեղափոխվի հակառակ ուղղությամբ, այն նախ պետք է ախտահանվի 10% նատրիումի հիպոքլորիտով, որին հաջորդում է ստերիլ ջրով սրբելը:

Նշում

10% նատրիումի հիպոքլորիտի լուծույթը պետք է թարմացվի ամեն օր։ Ախտահանման համար օգտագործելիս պետք է պահպանել առնվազն 10 րոպե շփման ժամանակ։
Այլընտրանքորեն, եթե տեղական անվտանգության առաջարկությունները թույլ չեն տալիս նատրիումի հիպոքլորիտի օգտագործումը, կամ եթե նատրիումի հիպոքլորիտը հարմար չէ սարքավորումների մետաղական մասերի ախտահանման համար, կարող են օգտագործվել առևտրային առումով մատչելի արտադրանքներ, որոնք վավերացված են որպես ԴՆԹ-ն քայքայող մակերեսային ախտահանիչներ:

Իդեալական դեպքում անձնակազմը պետք է հետևի միակողմանի աշխատանքային հոսքի էթոսին և նույն օրը չվերադառնա կեղտոտ տարածքներից (ՊՇՌ-ից հետո) մաքուր տարածքներ (ՊՇՌ-ից առաջ): Այնուամենայնիվ, կարող են լինել դեպքեր, երբ դա անխուսափելի է: Նման դեպքերում անձնակազմը պետք է զգույշ լինի ձեռքերը մանրակրկիտ լվանալու, ձեռնոցները փոխելու, նշանակված լաբորատոր խալաթը օգտագործելու և սենյակից դուրս հանելու համար նախատեսված որևէ սարքավորում չբերելու հարցում, օրինակ՝ լաբորատոր գրքեր: Նման վերահսկողության միջոցառումները պետք է շեշտը դնեն մոլեկուլային մեթոդների վերաբերյալ անձնակազմի վերապատրաստման վրա:

Օգտագործելուց հետո աշխատասեղանները պետք է մաքրվեն 10% նատրիումի հիպոքլորիտով (որին հաջորդում է ստերիլ ջրով՝ մնացորդային սպիտակեցնող նյութը հեռացնելու համար), 70% էթանոլով կամ վավերացված, առևտրային առումով մատչելի ԴՆԹ-ն քայքայող ախտահանիչով: Իդեալական դեպքում, ճառագայթման միջոցով ախտահանումը հնարավոր դարձնելու համար պետք է տեղադրվեն ուլտրամանուշակագույն (UV) լամպեր: Այնուամենայնիվ, UV լամպերի օգտագործումը պետք է սահմանափակվի փակ աշխատանքային տարածքներով, օրինակ՝ անվտանգության պահարաններով, որպեսզի սահմանափակվի լաբորատորիայի անձնակազմի ուլտրամանուշակագույն ճառագայթահարման ազդեցությունը: Խնդրում ենք հետևել արտադրողի հրահանգներին UV լամպերի խնամքի, օդափոխության և մաքրման վերաբերյալ՝ լամպերի արդյունավետությունը պահպանելու համար:

Եթե ​​նատրիումի հիպոքլորիտի փոխարեն օգտագործվում է 70% էթանոլ, ապա ախտահանումն ավարտելու համար անհրաժեշտ կլինի ճառագայթում ուլտրամանուշակագույն լույսով։
Մի՛ մաքրեք մրրկային պտույտը և ցենտրիֆուգը նատրիումի հիպոքլորիտով, փոխարենը սրբեք 70% էթանոլով և ենթարկեք ուլտրամանուշակագույն լույսի ազդեցությանը, կամ օգտագործեք ԴՆԹ-ն ոչնչացնող առևտրային ախտահանիչ: Թափված հեղուկի դեպքում դիմեք արտադրողին՝ լրացուցիչ մաքրման խորհուրդներ ստանալու համար: Եթե արտադրողի հրահանգները թույլ են տալիս, պիպետները պետք է պարբերաբար ախտահանվեն ավտոկլավով: Եթե պիպետները չեն կարող ավտոկլավացվել, բավարար կլինի դրանք մաքրել 10% նատրիումի հիպոքլորիտով (որին հաջորդում է ստերիլ ջրով մանրակրկիտ սրբումը) կամ ԴՆԹ-ն ոչնչացնող առևտրային ախտահանիչով, որին հաջորդում է ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման ազդեցությունը:

Բարձր տոկոսային պարունակությամբ նատրիումի հիպոքլորիտով մաքրումը կարող է ի վերջո վնասել պիպետի պլաստմասսաները և մետաղները, եթե այն պարբերաբար կատարվի։ Նախ ստուգեք արտադրողի առաջարկությունները։ Բոլոր սարքավորումները պետք է պարբերաբար կարգավորվեն արտադրողի կողմից առաջարկվող ժամանակացույցի համաձայն։ Նշանակված անձը պետք է պատասխանատու լինի կարգավորման ժամանակացույցի պահպանման, մանրամասն գրանցամատյանների պահպանման և սարքավորումների վրա սպասարկման պիտակների հստակ ցուցադրման համար։

3. Նշանակված մոլեկուլային տարածքի օգտագործման և մաքրման խորհուրդներ

Նախնական ՊՇՌ. Ռեակտիվների ալիքվոտավորում / մաստերմիքսի պատրաստում. Սա պետք է լինի մոլեկուլային փորձերի նախապատրաստման համար օգտագործվող բոլոր տարածքներից ամենամաքուրը և իդեալականորեն պետք է լինի նախատեսված լամինար հոսքի պահարան՝ հագեցած ուլտրամանուշակագույն լամպով: Այս տարածքում չպետք է մշակվեն նմուշներ, արդյունահանված նուկլեինաթթուներ և ուժեղացված ՊՇՌ արգասիքներ: Ուժեղացման ռեակտիվները պետք է պահվեն սառցախցիկում (կամ սառնարանում՝ ըստ արտադրողի առաջարկությունների) նույն նախատեսված տարածքում, իդեալականորեն՝ լամինար հոսքի պահարանի կամ նախնական ՊՇՌ տարածքի կողքին: Ձեռնոցները պետք է փոխվեն յուրաքանչյուր անգամ նախնական ՊՇՌ տարածք կամ լամինար հոսքի պահարան մտնելիս:

Նախնական ՊՇՌ տարածքը կամ լամինար հոսքի պահարանը պետք է մաքրվի օգտագործելուց առաջ և հետո հետևյալ կերպ. Պահարանի բոլոր իրերը, օրինակ՝ պիպետները, ծայրակալների տուփերը, մրրկային հոսքը, ցենտրիֆուգը, խողովակների դարակները, գրիչները և այլն, սրբեք 70% էթանոլով կամ առևտրային ԴՆԹ-ն ոչնչացնող ախտահանիչով և թողեք չորանա: Փակ աշխատանքային տարածքի դեպքում, օրինակ՝ լամինար հոսքի պահարանի դեպքում, կափարիչը ենթարկեք ուլտրամանուշակագույն լույսի ազդեցությանը 30 րոպե:

Նշում

Մի՛ ենթարկեք ռեակտիվները ուլտրամանուշակագույն լույսի ազդեցությանը. տեղափոխեք դրանք պահարան միայն այն բանից հետո, երբ այն մաքուր լինի: Եթե կատարում եք հակադարձ տրանսկրիպցիայի ՊՇՌ, օգտակար կլինի նաև մակերեսները և սարքավորումները սրբել լուծույթով, որը շփման ժամանակ քայքայում է ՌՆԹ-ն: Սա կարող է օգնել խուսափել ՌՆԹ-ի ֆերմենտային քայքայման կեղծ բացասական արդյունքներից: Ախտահանումից հետո և գլխավոր խառնուրդը պատրաստելուց առաջ ձեռնոցները պետք է կրկին փոխվեն, որից հետո պահարանը պատրաստ է օգտագործման:

Նախնական ՊՇՌ. Նուկլեինաթթվի արդյունահանում/շաբլոնի ավելացում.

Նուկլեինաթթուն պետք է արդյունահանվի և մշակվի երկրորդ նշանակված տարածքում՝ օգտագործելով պիպետների, ֆիլտրի ծայրերի, խողովակների դարակների, նոր ձեռնոցների, լաբորատոր խալաթների և այլ սարքավորումների առանձին հավաքածու։ Այս տարածքը նախատեսված է նաև մաստերխառնուրդի խողովակներին կամ թիթեղներին կաղապարի, վերահսկիչների և միտումային գծերի ավելացման համար։ Վերլուծվող արդյունահանված նուկլեինաթթվի նմուշների աղտոտումից խուսափելու համար խորհուրդ է տրվում փոխել ձեռնոցները դրական վերահսկիչների կամ ստանդարտների հետ գործ ունենալուց առաջ և օգտագործել պիպետների առանձին հավաքածու։ ՊՇՌ ռեակտիվները և ուժեղացված արտադրանքը չպետք է պիպետավորվեն այս տարածքում։ Նմուշները պետք է պահվեն նույն տարածքում գտնվող նշանակված սառնարաններում կամ սառցախցիկներում։ Նմուշի աշխատանքային տարածքը պետք է մաքրվի նույն կերպ, ինչպես մաստերխառնուրդի տարածքը։

Հետ-ՊՇՌ. Ամպլիֆիկացված արտադրանքի ամպլիֆիկացիա և մշակում

Այս նշանակված տարածքը նախատեսված է հետամպլիֆիկացիոն գործընթացների համար և պետք է ֆիզիկապես առանձնացված լինի ՊՇՌ-ից առաջ նախատեսված տարածքներից: Այն սովորաբար պարունակում է ջերմացիկլերներ և իրական ժամանակի հարթակներ, և իդեալականում պետք է ունենա լամինար հոսքի պահարան՝ 1-ին փուլի ՊՇՌ արգասիք 2-րդ փուլի ռեակցիային ավելացնելու համար, եթե իրականացվում է ներդրված ՊՇՌ: ՊՇՌ ռեակտիվների և արդյունահանված նուկլեինաթթուների հետ չպետք է շփվել այս տարածքում, քանի որ աղտոտման ռիսկը բարձր է: Այս տարածքում պետք է լինեն ձեռնոցների, լաբորատոր խալաթների, ափսեների և խողովակների դարակների, պիպետների, ֆիլտրի ծայրերի, աղբամանների և այլ սարքավորումների առանձին հավաքածու: Խողովակները պետք է ցենտրիֆուգացվեն բացելուց առաջ: Նմուշի աշխատանքային տարածքը պետք է մաքրվի նույն կերպ, ինչպես մաստերխառնուրդի տարածքը:

Հետ-ՊՇՌ. Արտադրանքի վերլուծություն

Այս սենյակը նախատեսված է արտադրանքի հայտնաբերման սարքավորումների համար, օրինակ՝ գելային էլեկտրոֆորեզի բալոններ, էլեկտրական մարտկոցներ, ուլտրամանուշակագույն տրանսիլումինատոր և գելի փաստաթղթավորման համակարգ: Այս տարածքում պետք է լինեն ձեռնոցների, լաբորատոր խալաթների, ափսեների և խողովակների դարակների, պիպետների, ֆիլտրի ծայրակալների, տարաների և այլ սարքավորումների առանձին հավաքածուներ: Այս տարածք չի կարելի բերել այլ ռեակտիվներ, բացառությամբ բեռնման ներկանյութի, մոլեկուլային մարկերների և ագարոզային գելի, ինչպես նաև բուֆերային բաղադրիչների: Նմուշի աշխատանքային տարածքը պետք է մաքրվի նույն կերպ, ինչպես մաստերխառնուրդի տարածքը:

Կարևոր նշում

Իդեալական դեպքում, ՊՇՌ-ից առաջ սենյակներ չպետք է մուտք գործել նույն օրը, եթե աշխատանքն արդեն կատարվել է ՊՇՌ-ից հետո սենյակներում: Եթե դա բացարձակապես անխուսափելի է, համոզվեք, որ ձեռքերը նախապես մանրակրկիտ լվացվել են և սենյակներում կրվել են հատուկ լաբորատոր խալաթներ: Լաբորատոր գրքերն ու փաստաթղթերը չպետք է տարվեն ՊՇՌ-ից առաջ սենյակներ, եթե դրանք օգտագործվել են ՊՇՌ-ից հետո սենյակներում. անհրաժեշտության դեպքում վերցրեք արձանագրությունների/նմուշների նույնականացուցիչների և այլնի պատճենները:

4. Մոլեկուլային կենսաբանության ընդհանուր խորհրդատվություն

Օգտագործեք փոշեհանազուրկ ձեռնոցներ՝ փորձարկման արգելակումից խուսափելու համար: Պիպեցման ճիշտ տեխնիկան չափազանց կարևոր է աղտոտվածությունը նվազեցնելու համար: Սխալ պիպեցումը կարող է հանգեցնել հեղուկներ բաշխելիս ցայտքի և աէրոզոլների առաջացման: Ճիշտ պիպեցման լավ պրակտիկան կարելի է գտնել հետևյալ հղումներում՝ Գիլսոնի ուղեցույց պիպեցման համար, Անաքեմի պիպեցման տեխնիկայի տեսանյութեր, Ցենտրիֆուգացրեք խողովակները բացելուց առաջ և զգուշորեն բացեք դրանք՝ ցայտքից խուսափելու համար: Օգտագործելուց անմիջապես հետո փակեք խողովակները՝ աղտոտիչների ներթափանցումը կանխելու համար:

Բազմաթիվ ռեակցիաներ կատարելիս պատրաստեք մեկ մաստերխառնուրդ, որը պարունակում է ընդհանուր ռեակտիվներ (օրինակ՝ ջուր, dNTP-ներ, բուֆեր, պրայմերներ և ֆերմենտ)՝ ռեակտիվների փոխանցումների քանակը նվազագույնի հասցնելու և աղտոտման վտանգը նվազեցնելու համար: Խորհուրդ է տրվում մաստերխառնուրդը տեղադրել սառույցի կամ սառը բլոկի վրա: Տաք մեկնարկի ֆերմենտի օգտագործումը կարող է օգնել նվազեցնել ոչ սպեցիֆիկ արտադրանքի արտադրությունը: Պաշտպանեք լյումինեսցենտային զոնդեր պարունակող ռեակտիվները լույսից՝ քայքայումից խուսափելու համար:

5. Ներքին վերահսկողություն

Ներառեք լավ բնութագրված, հաստատված դրական և բացասական վերահսկիչներ, ինչպես նաև բոլոր ռեակցիաներում առանց ձևանմուշի վերահսկիչ, և քանակական ռեակցիաների համար բազմակետային տիտրացված միտման գիծ: Դրական վերահսկիչը չպետք է այնքան ուժեղ լինի, որ աղտոտման ռիսկ առաջացնի: Նուկլեինաթթվի արդյունահանում կատարելիս ներառեք դրական և բացասական արդյունահանման վերահսկիչներ:

Խորհուրդ է տրվում յուրաքանչյուր տարածքում փակցնել հստակ հրահանգներ, որպեսզի օգտատերերը տեղյակ լինեն վարքագծի կանոններին: Կլինիկական նմուշներում ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի շատ ցածր մակարդակներ հայտնաբերող ախտորոշիչ լաբորատորիաները կարող են լրացուցիչ անվտանգության միջոցառում ձեռնարկել՝ ՊՇՌ-ից առաջ սենյակներում ունենալով թեթևակի դրական օդի ճնշում, իսկ ՊՇՌ-ից հետո սենյակներում՝ թեթևակի բացասական օդի ճնշում:

Վերջապես, օգտակար է որակի ապահովման (ՈԱ) պլանի մշակումը: Նման պլանը պետք է ներառի ռեակտիվների հիմնական պաշարների և աշխատանքային պաշարների ցանկեր, հավաքածուների և ռեակտիվների պահեստավորման կանոններ, վերահսկողության արդյունքների մասին հաշվետվություններ, անձնակազմի վերապատրաստման ծրագրեր, խնդիրների լուծման ալգորիթմներ և անհրաժեշտության դեպքում շտկողական գործողություններ:

6. Մատենագրություն

Ասլան Ա, Կինզելման Ջ, Դրիլին Ե, Անանևա Տ, Լավանդեր Ջ. Գլուխ 3. QPCR լաբորատորիայի ստեղծում: USEPA qPCR մեթոդ 1611-ի միջոցով հանգստի համար նախատեսված ջրերի փորձարկման ուղեցույց: Լանսինգ-Միչիգանի պետական ​​համալսարան:

Անգլիայի հանրային առողջապահություն, Ազգային առողջապահական ծառայություն։ Մեծ Բրիտանիայի մանրէաբանական հետազոտությունների չափորոշիչներ. Լավ լաբորատոր պրակտիկա մոլեկուլային ուժեղացման փորձարկումներ կատարելիս։ Որակի ուղեցույց։ 2013;4(4):1–15։

Միֆլին Թ. ՊՇՌ լաբորատորիայի հիմնում: Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.

Շրյոդեր Ս. 2013թ. Ցենտրիֆուգների ընթացիկ սպասարկում. ցենտրիֆուգների, ռոտորների և ադապտերների մաքրում, սպասարկում և ախտահանում (Սպիտակ թուղթ № 14): Համբուրգ. Էպենդորֆ; 2013թ.:

Վիանա Ռ.Վ., Ուոլիս Կ.Լ.: Ախտորոշիչ լաբորատորիաներում օգտագործվող մոլեկուլային թեստերի համար լավ կլինիկական լաբորատոր պրակտիկա (GCLP), Ակյար Ի.-ի խմբագրությամբ: Որակի վերահսկողության լայն սպեկտր: Ռիեկա, Խորվաթիա. Intech; 2011: 29–52: