Molekularne metode detekcije imaju sposobnost proizvodnje velikog volumena nukleinske kiseline amplifikacijom tragova pronađenih u uzorcima. Iako je to korisno za omogućavanje osjetljive detekcije, također uvodi mogućnost kontaminacije širenjem aerosola amplifikacije u laboratorijskom okruženju. Prilikom provođenja eksperimenata mogu se poduzeti mjere kako bi se izbjegla kontaminacija reagensa, laboratorijske opreme i prostora na radnom stolu, jer takva kontaminacija može generirati lažno pozitivne (ili lažno negativne) rezultate.
Kako bi se smanjila vjerojatnost kontaminacije, uvijek treba provoditi Dobru laboratorijsku praksu. Posebno treba poduzeti mjere opreza u vezi sa sljedećim točkama:
1. Rukovanje reagensima
2. Organizacija radnog prostora i opreme
3. Savjeti za korištenje i čišćenje određenog molekularnog prostora
4. Opći savjeti iz molekularne biologije
5. Interne kontrole
6. Bibliografija
1. Rukovanje reagensima
Prije otvaranja kratko centrifugirajte epruvete s reagensima kako biste izbjegli stvaranje aerosola. Odvojite reagense u alikvote kako biste izbjegli višestruko smrzavanje i odmrzavanje i kontaminaciju glavnih zaliha. Jasno označite i datirajte sve epruvete s reagensima i reakcijama te vodite evidenciju brojeva serija i šarži reagensa korištenih u svim eksperimentima. Pipetirajte sve reagense i uzorke pomoću filter vrhova. Prije kupnje preporučljivo je provjeriti s proizvođačem odgovaraju li filter vrhovi marki pipete koja će se koristiti.
2. Organizacija radnog prostora i opreme
Radni prostor treba biti organiziran tako da se osigura da se tijek rada odvija u jednom smjeru, od čistih područja (prije PCR-a) do prljavih područja (nakon PCR-a). Sljedeće opće mjere opreza pomoći će u smanjenju mogućnosti kontaminacije. Imajte odvojene određene prostorije ili barem fizički odvojena područja za: pripremu mastermixa, ekstrakciju nukleinske kiseline i dodavanje DNA predloška, amplifikaciju i rukovanje amplificiranim produktom te analizu produkta, npr. gel elektroforeza.
U nekim okruženjima je teško imati 4 odvojene prostorije. Moguća, ali manje poželjna opcija je priprema mastermixa u zaštitnom prostoru, npr. laminarnom kabinetu. U slučaju ugniježđene PCR amplifikacije, priprema mastermixa za drugi krug reakcije treba se obaviti u 'čistom' prostoru za pripremu mastermixa, ali inokulacija primarnim PCR produktom treba se obaviti u prostoriji za amplifikaciju i, ako je moguće, u namjenskom zaštitnom prostoru (npr. laminarnom kabinetu).
Svaka soba/prostor treba zaseban set jasno označenih pipeta, filterskih nastavaka, stalaka za epruvete, vrtloga, centrifuga (ako je primjenjivo), olovaka, generičkih laboratorijskih reagensa, laboratorijskih ogrtača i kutija s rukavicama koje će ostati na odgovarajućim radnim mjestima. Ruke se moraju oprati, a rukavice i laboratorijski ogrtači mijenjati prilikom kretanja između određenih područja. Reagensi i oprema ne smiju se premještati iz prljavog u čisto područje. U ekstremnim slučajevima kada se reagens ili dio opreme mora premjestiti unatrag, prvo se mora dekontaminirati s 10%-tnom otopinom natrijevog hipoklorita, a zatim obrisati sterilnom vodom.
Bilješka
10%-tna otopina natrijevog hipoklorita mora se pripremati svježa svakodnevno. Kada se koristi za dekontaminaciju, treba se pridržavati minimalnog vremena kontakta od 10 minuta.
Alternativno, mogu se koristiti komercijalno dostupni proizvodi koji su validirani kao površinska dekontaminanta koja uništavaju DNK ako lokalne sigurnosne preporuke ne dopuštaju upotrebu natrijevog hipoklorita ili ako natrijev hipoklorit nije prikladan za dekontaminaciju metalnih dijelova opreme.
Idealno bi bilo da se osoblje pridržava etosa jednosmjernog tijeka rada i da se ne vraća iz prljavih područja (nakon PCR-a) u čista područja (prije PCR-a) istog dana. Međutim, mogu postojati slučajevi kada je to neizbježno. Kada se takva prilika pojavi, osoblje mora temeljito oprati ruke, promijeniti rukavice, koristiti za to predviđeni laboratorijski ogrtač i ne unositi nikakvu opremu koju će ponovno htjeti iznijeti iz prostorije, poput laboratorijskih knjiga. Takve kontrolne mjere treba naglasiti u obuci osoblja o molekularnim metodama.
Nakon upotrebe, radne površine treba očistiti 10%-tnom otopinom natrijevog hipoklorita (nakon čega slijedi sterilna voda za uklanjanje ostataka izbjeljivača), 70%-tnim etanolom ili validiranim komercijalno dostupnim dekontaminantom koji uništava DNK. Idealno bi bilo ugraditi ultraljubičaste (UV) lampe kako bi se omogućila dekontaminacija zračenjem. Međutim, upotreba UV lampi treba biti ograničena na zatvorene radne prostore, npr. sigurnosne ormare, kako bi se ograničila izloženost laboratorijskog osoblja UV zračenju. Molimo pridržavajte se uputa proizvođača za njegu, ventilaciju i čišćenje UV lampi kako biste osigurali da lampe ostanu učinkovite.
Ako se umjesto natrijevog hipoklorita koristi 70%-tni etanol, za dovršetak dekontaminacije bit će potrebno ozračivanje UV svjetlom.
Ne čistite vortex i centrifugu natrijevim hipokloritom; umjesto toga, obrišite 70%-tnim etanolom i izložite UV svjetlu ili upotrijebite komercijalno sredstvo za dekontaminaciju DNK. U slučaju prolijevanja, obratite se proizvođaču za daljnje savjete o čišćenju. Ako upute proizvođača to dopuštaju, pipete treba rutinski sterilizirati u autoklavu. Ako se pipete ne mogu autoklavirati, dovoljno ih je očistiti 10%-tnim natrijevim hipokloritom (nakon čega slijedi temeljito brisanje sterilnom vodom) ili komercijalnim sredstvom za dekontaminaciju DNK, a zatim izlaganje UV svjetlu.
Čišćenje visokopostotnim natrijevim hipokloritom može na kraju oštetiti plastiku i metale pipeta ako se provodi redovito; prvo provjerite preporuke proizvođača. Svu opremu potrebno je redovito kalibrirati prema rasporedu koji preporučuje proizvođač. Određena osoba trebala bi biti zadužena za osiguravanje pridržavanja rasporeda kalibracije, vođenje detaljnih zapisa i jasno prikazivanje servisnih naljepnica na opremi.
3. Savjeti za korištenje i čišćenje određenog molekularnog prostora
Pred-PCR: Alikvotiranje reagensa / priprema mastermiksa: Ovo bi trebao biti najčišći od svih prostora koji se koriste za pripremu molekularnih eksperimenata i idealno bi trebao biti određeni laminarni kabinet opremljen UV svjetlom. Uzorci, ekstrahirana nukleinska kiselina i amplificirani PCR produkti ne smiju se rukovati u ovom području. Amplifikacijski reagensi trebaju se čuvati u zamrzivaču (ili hladnjaku, prema preporukama proizvođača) u istom određenom prostoru, idealno pored laminarnog kabineta ili pred-PCR područja. Rukavice treba mijenjati svaki put pri ulasku u pred-PCR područje ili laminarni kabinet.
Područje prije PCR-a ili laminarni kabinet treba očistiti prije i nakon upotrebe na sljedeći način: Obrišite sve predmete u kabinetu, npr. pipete, kutije za vrhove, vortex, centrifugu, stalke za epruvete, olovke itd. sa 70%-tnim etanolom ili komercijalnim dekontaminantom koji uništava DNK i ostavite da se osuši. U slučaju zatvorenog radnog prostora, npr. laminarnog kabineta, izložite poklopac UV svjetlu 30 minuta.
Bilješka
Ne izlažite reagense UV svjetlu; premjestite ih u kabinet tek kada je čist. Ako se izvodi PCR s reverznom transkripcijom, korisno je obrisati površine i opremu otopinom koja razgrađuje RNaze pri kontaktu. To može pomoći u izbjegavanju lažno negativnih rezultata od enzimske razgradnje RNK. Nakon dekontaminacije i prije pripreme mastermixa, rukavice treba još jednom promijeniti, a zatim je kabinet spreman za upotrebu.
Prije PCR-a: Ekstrakcija nukleinskih kiselina/dodavanje predloška:
Nukleinska kiselina mora se ekstrahirati i s njom se rukovati u drugom određenom području, koristeći zaseban set pipeta, filterskih nastavaka, stalke za epruvete, nove rukavice, laboratorijske kute i drugu opremu. Ovo područje također služi za dodavanje predloška, kontrola i linija trenda u epruvete ili ploče s mastermixom. Kako bi se izbjegla kontaminacija ekstrahiranih uzoraka nukleinskih kiselina koji se analiziraju, preporučuje se promjena rukavica prije rukovanja pozitivnim kontrolama ili standardima te korištenje zasebnog seta pipeta. PCR reagensi i amplificirani produkti ne smiju se pipetirati u ovom području. Uzorke treba čuvati u određenim hladnjacima ili zamrzivačima u istom području. Radni prostor za uzorke treba čistiti na isti način kao i prostor s mastermixom.
Nakon PCR-a: Amplifikacija i rukovanje amplificiranim produktom
Ovaj određeni prostor namijenjen je za procese nakon amplifikacije i trebao bi biti fizički odvojen od područja prije PCR-a. Obično sadrži termociklere i platforme u stvarnom vremenu, a idealno bi bilo da ima laminarni protočni kabinet za dodavanje PCR produkta iz 1. kruga u reakciju iz 2. kruga, ako se provodi ugniježđena PCR. PCR reagensi i ekstrahirana nukleinska kiselina ne smiju se rukovati u ovom području jer je rizik od kontaminacije visok. Ovo područje trebalo bi imati zaseban set rukavica, laboratorijskih ogrtača, nosača ploča i epruveta, pipeta, filterskih vrhova, spremnika i ostale opreme. Epruvete se moraju centrifugirati prije otvaranja. Radni prostor za uzorke treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermix.
Post-PCR: Analiza produkta
Ova je prostorija namijenjena za opremu za detekciju proizvoda, npr. spremnike za gel elektroforezu, baterije, UV transiluminator i sustav za dokumentiranje gela. Ovo područje treba imati odvojene setove rukavica, laboratorijske kute, stalke za ploče i epruvete, pipete, filterske vrhove, spremnike i drugu opremu. U ovo područje ne smiju se unositi drugi reagensi, osim boje za punjenje, molekularnog markera i agaroznog gela te komponenti pufera. Radni prostor za uzorke treba čistiti na isti način kao i prostor za mastermix.
Važna napomena
Idealno bi bilo da se u sobe za prije-PCR analize ne ulaze istog dana ako je rad već obavljen u sobama za poslije-PCR analize. Ako je to potpuno neizbježno, prvo temeljito operite ruke i nosite posebne laboratorijske kute u sobama. Laboratorijske knjige i papirologija ne smiju se unositi u sobe za prije-PCR analize ako su korištene u sobama za poslije-PCR analize; ako je potrebno, napravite duplikate ispisa protokola/identifikacijskih brojeva uzoraka itd.
4. Opći savjeti iz molekularne biologije
Koristite rukavice bez pudera kako biste izbjegli inhibiciju testa. Ispravna tehnika pipetiranja ključna je za smanjenje kontaminacije. Nepravilno pipetiranje može dovesti do prskanja prilikom doziranja tekućina i stvaranja aerosola. Dobre prakse za pravilno pipetiranje možete pronaći na sljedećim poveznicama: Gilsonov vodič za pipetiranje, Anachemovi videozapisi o tehnici pipetiranja, Centrifugirajte epruvete prije otvaranja i pažljivo ih otvorite kako biste izbjegli prskanje. Zatvorite epruvete odmah nakon upotrebe kako biste izbjegli unošenje kontaminanata.
Prilikom izvođenja više reakcija, pripremite jednu mastermix smjesu koja sadrži uobičajene reagense (npr. vodu, dNTP-ove, pufer, primere i enzim) kako biste smanjili broj prijenosa reagensa i smanjili opasnost od kontaminacije. Preporučuje se postavljanje mastermixa na led ili hladni blok. Korištenje enzima Hot Start može pomoći u smanjenju proizvodnje nespecifičnih produkata. Zaštitite reagense koji sadrže fluorescentne probe od svjetlosti kako biste izbjegli njihovu degradaciju.
5. Interne kontrole
Uključite dobro karakterizirane, potvrđene pozitivne i negativne kontrole, zajedno s kontrolom bez predloška u svim reakcijama i višetočkovnom titriranom linijom trenda za kvantitativne reakcije. Pozitivna kontrola ne smije biti toliko jaka da predstavlja rizik od kontaminacije. Uključite pozitivne i negativne kontrole ekstrakcije prilikom ekstrakcije nukleinske kiseline.
Preporučuje se da se u svakom području postave jasne upute kako bi korisnici bili svjesni pravila ponašanja. Dijagnostički laboratoriji koji otkrivaju vrlo niske razine DNK ili RNK u kliničkim uzorcima mogu usvojiti dodatnu sigurnosnu mjeru u vidu odvojenih sustava za obradu zraka s blago pozitivnim tlakom zraka u prostorijama prije PCR-a i blago negativnim tlakom zraka u prostorijama nakon PCR-a.
Konačno, koristan je razvoj plana osiguranja kvalitete (QA). Takav plan trebao bi uključivati popise glavnih i radnih zaliha reagensa, pravila za skladištenje kompleta i reagensa, izvještavanje o rezultatima kontrole, programe obuke osoblja, algoritme za rješavanje problema i korektivne mjere kada je to potrebno.
6. Bibliografija
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Poglavlje 3: Postavljanje qPCR laboratorija. Smjernice za testiranje rekreacijskih voda korištenjem USEPA qPCR metode 1611. Lansing - Državno sveučilište Michigan.
Javno zdravstvo Engleske, NHS. Standardi Ujedinjenog Kraljevstva za mikrobiološka istraživanja: Dobra laboratorijska praksa pri provođenju testova molekularne amplifikacije. Smjernice za kvalitetu. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Osnivanje PCR laboratorija. Cold Spring Harb Protoc. 2007.;7.
Schroeder S 2013. Rutinsko održavanje centrifuga: čišćenje, održavanje i dezinfekcija centrifuga, rotora i adaptera (Bijela knjiga br. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Dobra klinička laboratorijska praksa (GCLP) za molekularno utemeljene testove koji se koriste u dijagnostičkim laboratorijima, U: Akyar I, urednik. Široki spektar kontrole kvalitete. Rijeka, Hrvatska: Intech; 2011: 29–52.
Vrijeme objave: 16. srpnja 2020.
