Tá an cumas ag modhanna braite móilíneacha méid mór d’aigéad núicléasach a tháirgeadh trí aimpliú rianmhéideanna a fhaightear i samplaí. Cé go bhfuil sé seo tairbheach chun braiteadh íogair a chumasú, tugann sé isteach an fhéidearthacht freisin go dtarlóidh éilliú trí scaipeadh aerasól aimpliúcháin i dtimpeallacht na saotharlainne. Agus turgnaimh á ndéanamh, is féidir bearta a dhéanamh chun éilliú imoibrithe, trealaimh saotharlainne agus spáis binse a sheachaint, toisc go bhféadfadh éilliú den sórt sin torthaí dearfacha bréagacha (nó diúltacha bréagacha) a ghiniúint.
Chun cabhrú le dóchúlacht éillithe a laghdú, ba cheart Dea-Chleachtas Saotharlainne a chleachtadh i gcónaí. Go sonrach, ba cheart réamhchúraimí a ghlacadh maidir leis na pointí seo a leanas:
1. Láimhseáil imoibrithe
2. Eagrú an spáis oibre agus an trealaimh
3. Comhairle úsáide agus glantacháin don spás móilíneach ainmnithe
4. Comhairle ghinearálta maidir le bitheolaíocht mhóilíneach
5. Rialuithe inmheánacha
6. Leabharliosta
1. Láimhseáil imoibrithe
Lártheifneoirigh na feadáin imoibrithe go hachomair sula n-osclaítear iad chun giniúint aerasól a sheachaint. Roinn na himoibrithe go léir chun reo-leá iolracha agus éilliú na máistirstoc a sheachaint. Lipéadaigh agus dátaigh go soiléir na feadáin imoibrithe agus imoibrithe go léir agus coinnigh logaí d'uimhreacha baisce agus bhaisc na n-imoibrithe a úsáidtear i ngach turgnamh. Déan na himoibrithe agus na samplaí go léir a phípéadú ag baint úsáide as bairr scagaire. Sula gceannaítear iad, moltar a dheimhniú leis an monaróir go n-oireann na bairr scagaire don bhranda pípéid atá le húsáid.
2. Eagrú an spáis oibre agus an trealaimh
Ba chóir an spás oibre a eagrú chun a chinntiú go dtarlaíonn sreabhadh na hoibre i dtreo amháin, ó cheantair ghlana (réamh-PCR) go ceantair shalacha (iar-PCR). Cabhróidh na réamhchúraimí ginearálta seo a leanas le seans éillithe a laghdú. Bíodh seomraí ainmnithe ar leithligh agat, nó ar a laghad ceantair atá scartha go fisiciúil, le haghaidh: ullmhú máistir-mheascáin, eastóscadh aigéid núicléasaigh agus cur teimpléid DNA leis, aimpliú agus láimhseáil táirge aimplithe, agus anailís táirgí, m.sh. leictreafóiréis glóthaí.
I roinnt suíomhanna, bíonn sé deacair ceithre sheomra ar leith a bheith agat. Rogha fhéideartha ach nach bhfuil chomh inmhianaithe is ea an máistir-mheascán a ullmhú i limistéar coimeádta, m.sh. caibinéad sreafa laminar. I gcás aimpliú PCR neadaithe, ba cheart ullmhú an mháistir-mheascáin don dara babhta imoibrithe a ullmhú sa limistéar 'glan' le haghaidh ullmhú an mháistir-mheascáin, ach ba cheart an ionaclú leis an bpríomhtháirge PCR a dhéanamh sa seomra aimplithe, agus más féidir i limistéar coimeádta tiomnaithe (m.sh. caibinéad sreafa laminar).
I ngach seomra/limistéar, teastaíonn sraith ar leith de phípéid, bairr scagaire, racaí feadán, vortexes, lártheifneoirí (más infheidhme), pinn, imoibrithe saotharlainne cineálacha, cótaí saotharlainne agus boscaí lámhainní a fhanfaidh ag a stáisiúin oibre faoi seach. Ní mór lámha a ní agus lámhainní agus cótaí saotharlainne a athrú agus tú ag bogadh idir na limistéir ainmnithe. Níor cheart imoibrithe agus trealamh a bhogadh ó limistéar salach go limistéar glan. Má tharlaíonn cás foircneach ina gcaithfear imoibrí nó píosa trealaimh a bhogadh siar, ní mór é a dhí-éilliú ar dtús le hipeaclóirít sóidiam 10%, agus ansin é a ghlanadh le huisce steiriúil.
Nóta
Ní mór an tuaslagán 10% hipeaclóiríte sóidiam a dhéanamh úr gach lá. Nuair a úsáidtear é le haghaidh dí-éillithe, ba chóir cloí le ham teagmhála íosta de 10 nóiméad.
Nó is féidir táirgí atá ar fáil go tráchtála agus atá bailíochtú mar dhí-éillitheoirí dromchla a scriosann DNA a úsáid mura gceadaíonn moltaí sábháilteachta áitiúla úsáid hipeaclóirít sóidiam nó mura bhfuil hipeaclóirít sóidiam oiriúnach chun páirteanna miotalacha trealaimh a dhí-éilliú.
Go hidéalach, ba chóir don fhoireann cloí leis an eiteas sreabhadh oibre aontreo agus gan dul ó cheantair shalacha (iar-PCR) ar ais go ceantair ghlana (réamh-PCR) an lá céanna. Mar sin féin, d’fhéadfadh go mbeadh amanna ann nach féidir é seo a sheachaint. Nuair a thagann ócáid den sórt sin chun cinn, ní mór do bhaill foirne a bheith cúramach a lámha a ní go críochnúil, lámhainní a athrú, an cóta saotharlainne ainmnithe a úsáid agus gan aon trealamh a thabhairt isteach ar mian leo a thógáil amach as an seomra arís, amhail leabhair saotharlainne. Ba chóir béim a chur ar bhearta rialaithe den sórt sin in oiliúint foirne ar mhodhanna móilíneacha.
Tar éis úsáide, ba chóir spásanna binse a ghlanadh le 10% hipeaclóirít sóidiam (agus ansin uisce steiriúil chun bleach iarmharach a bhaint), 70% eatánól, nó díthocsainitheoir scriosta DNA atá bailíochtú agus atá ar fáil go tráchtála. Go hidéalach, ba chóir lampaí ultraivialait (UV) a fheistiú chun díthocsainiú trí radaíocht a chumasú. Mar sin féin, ba chóir úsáid lampaí UV a shrianadh do limistéir oibre dúnta, m.sh. caibinéid sábháilteachta, chun nochtadh UV fhoireann na saotharlainne a theorannú. Cloí le treoracha an mhonaróra maidir le cúram, aeráil agus glanadh lampaí UV chun a chinntiú go bhfanann lampaí éifeachtach.
Má tá eatánól 70% á úsáid in ionad hipeaclóirít sóidiam, beidh gá le radaíocht le solas UV chun an dí-éilliú a chríochnú.
Ná glan an vortex ná an lártheifneoir le hipeaclóirít sóidiam; ina ionad sin, glan le 70% eatánól agus nochtaigh do sholas UV é, nó bain úsáid as díthocsainitheoir tráchtála a scriosann DNA. I gcás doirteadh, déan teagmháil leis an monaróir le haghaidh tuilleadh comhairle maidir le glanadh. Má cheadaíonn treoracha an mhonaróra é, ba chóir pipéidí a steiriliú go rialta le huathchlábhóir. Mura féidir pipéidí a uathchlábhú, ba chóir go mbeadh sé leordhóthanach iad a ghlanadh le hipeaclóirít sóidiam 10% (agus ansin iad a ghlanadh go críochnúil le huisce steiriúil) nó le díthocsainitheoir tráchtála a scriosann DNA agus ansin nochtadh UV.
D’fhéadfadh glanadh le hipeaclóirít sóidiam ardchéatadáin damáiste a dhéanamh do phlaistigh agus do mhiotail phípéad sa deireadh má dhéantar é go rialta; seiceáil moltaí an mhonaróra ar dtús. Ní mór gach trealamh a chalabrú go rialta de réir an sceidil a mholann an monaróir. Ba chóir go mbeadh duine ainmnithe i gceannas ar a chinntiú go gcloítear leis an sceideal calabrúcháin, go gcoimeádtar logaí mionsonraithe, agus go bhfuil lipéid seirbhíse ar taispeáint go soiléir ar an trealamh.
3. Comhairle úsáide agus glantacháin don spás móilíneach ainmnithe
Réamh-PCR: Sliocht imoibrithe / ullmhú máistir-mheascáin: Ba chóir gurb é seo an spás is glaine de na spásanna uile a úsáidtear chun turgnaimh mhóilíneacha a ullmhú agus ba chóir go mbeadh sé ina chomh-aireachta sreafa laminar ainmnithe atá feistithe le solas UV. Ní mór samplaí, aigéad núicléasach eastósctha agus táirgí PCR aimplithe a láimhseáil sa limistéar seo. Ba chóir imoibrithe aimplithe a choinneáil i reoiteoir (nó cuisneoir, de réir mholtaí an mhonaróra) san spás ainmnithe céanna, go hidéalach in aice leis an gcomh-aireachta sreafa laminar nó leis an limistéar réamh-PCR. Ba chóir lámhainní a athrú gach uair a théann tú isteach sa limistéar réamh-PCR nó sa chomh-aireachta sreafa laminar.
Ba chóir an limistéar réamh-PCR nó an caibinéad sreafa laminar a ghlanadh roimh agus tar éis úsáide mar seo a leanas: Glan síos gach rud sa chaibinéad, m.sh. pipéidí, boscaí leideanna, vortex, lártheifneoir, racaí feadán, pinn, srl. le 70% eatánól nó díthocsainitheoir tráchtála a scriosann DNA, agus lig dóibh triomú. I gcás limistéar oibre dúnta, m.sh. caibinéad sreafa laminar, nochtaigh an cochall do sholas UV ar feadh 30 nóiméad.
Nóta
Ná nochtaigh imoibrithe do sholas UV; ná bog isteach sa chomh-aireachta iad ach amháin nuair a bheidh sé glan. Má tá PCR trascríobh droim ar ais á dhéanamh agat, d’fhéadfadh sé a bheith ina chuidiú freisin dromchlaí agus trealamh a ghlanadh le tuaslagán a bhriseann síos RNases ar theagmháil. D’fhéadfadh sé seo cabhrú le torthaí diúltacha bréagacha a sheachaint ó dhíghrádú einsímí ar RNA. Tar éis dí-éillithe agus sula n-ullmhaítear an máistir-mheascán, ba chóir lámhainní a athrú arís, agus ansin bíonn an comh-aireachta réidh le húsáid.
Réamh-PCR: Eastóscadh aigéid núicléasaigh/breis teimpléid:
Ní mór aigéad núicléasach a bhaint agus a láimhseáil i limistéar ainmnithe eile, ag baint úsáide as sraith ar leithligh pípéid, bairr scagaire, racaí feadán, lámhainní úra, cótaí saotharlainne agus trealamh eile. Tá an limistéar seo ann freisin chun teimpléad, rialuithe agus línte treochta a chur leis na feadáin nó na plátaí máistir-mheascáin. Chun éilliú na samplaí aigéad núicléasach eastósctha atá á n-anailísiú a sheachaint, moltar lámhainní a athrú sula ndéantar rialuithe dearfacha nó caighdeáin a láimhseáil agus sraith ar leithligh pípéid a úsáid. Ní mór imoibrithe PCR agus táirgí aimplithe a phípéadú sa limistéar seo. Ba chóir samplaí a stóráil i gcuisneoirí nó i reoiteoirí ainmnithe sa limistéar céanna. Ba chóir an spás oibre samplach a ghlanadh ar an mbealach céanna leis an spás máistir-mheascáin.
Iar-PCR: Aimpliú agus láimhseáil an táirge aimplithe
Tá an spás ainmnithe seo le haghaidh próisis iar-aimpliúcháin agus ba chóir go mbeadh sé scartha go fisiciúil ó na limistéir réamh-PCR. De ghnáth bíonn teirmeachicleoirí agus ardáin fíor-ama ann, agus go hidéalach ba chóir go mbeadh caibinéad sreafa laminar ann chun táirge PCR bhabhta 1 a chur leis an imoibriú babhta 2, má tá PCR neadaithe á dhéanamh. Ní mór imoibrithe PCR agus aigéad núicléasach eastósctha a láimhseáil sa limistéar seo ós rud é go bhfuil an baol éillithe ard. Ba chóir go mbeadh sraith ar leith lámhainní, cótaí saotharlainne, racaí pláta agus feadán, pipéidí, leideanna scagaire, boscaí bruscair agus trealamh eile sa limistéar seo. Ní mór feadáin a lártheifneoiriú sula n-osclaítear iad. Ba chóir an spás oibre samplach a ghlanadh ar an mbealach céanna leis an spás máistir-mheascáin.
Iar-PCR: Anailís táirgí
Tá an seomra seo le haghaidh trealaimh braite táirgí, m.sh. umair leictreafóiréis glóthaí, pacáistí cumhachta, tras-shoilsitheoir UV agus an córas doiciméadaithe glóthaí. Ba chóir go mbeadh tacair ar leithligh lámhainní, cótaí saotharlainne, racaí pláta agus feadán, pipéidí, bairr scagaire, boscaí bruscair agus trealamh eile sa limistéar seo. Ní féidir aon imoibrithe eile a thabhairt isteach sa limistéar seo, seachas ruaim luchtaithe, marcóir móilíneach agus glóthach agaróise, agus comhpháirteanna maolánacha. Ba chóir an spás oibre samplach a ghlanadh ar an mbealach céanna leis an spás máistir-mheascáin.
Nóta tábhachtach
Go hidéalach, níor cheart dul isteach sna seomraí réamh-PCR an lá céanna má tá obair déanta cheana féin sna seomraí iar-PCR. Mura féidir é seo a sheachaint ar chor ar bith, cinntigh go nítear do lámha go maith ar dtús agus go gcaitear cótaí saotharlainne sonracha sna seomraí. Ní mór leabhair saotharlainne agus páipéarachas a thabhairt isteach sna seomraí réamh-PCR má úsáideadh iad sna seomraí iar-PCR; más gá, tóg priontaí dúblacha de phrótacail/aitheantais samplaí, etc.
4. Comhairle ghinearálta maidir le bitheolaíocht mhóilíneach
Bain úsáid as lámhainní gan phúdar chun cosc ar an anailís a sheachaint. Tá an teicníc cheart pípéadaithe ríthábhachtach chun éilliú a laghdú. Is féidir le pípéadú mícheart splancscáileán a bheith mar thoradh air agus leachtanna á ndáileadh agus cruthú aerasól. Is féidir dea-chleachtas maidir le pípéadú ceart a fháil ag na naisc seo a leanas: treoir Gilson maidir le pípéadú, físeáin teicníc pípéadaithe Anachem, feadáin lártheifneoirithe roimh oscailt, agus oscail go cúramach iad chun splancscáileán a sheachaint. Dún na feadáin díreach tar éis úsáide chun tabhairt isteach truailleán a sheachaint.
Agus imoibrithe iolracha á ndéanamh, ullmhaigh máistir-mheascán amháin ina bhfuil imoibrithe coitianta (m.sh. uisce, dNTPanna, maolán, tosaitheoirí agus einsím) chun líon na n-aistrithe imoibrithe a íoslaghdú agus an baol éillithe a laghdú. Moltar an máistir-mheascán a chur ar bun ar oighear nó ar bhloc fuar. D’fhéadfadh úsáid einsím Tús Te cabhrú le táirgeadh táirgí neamhshonracha a laghdú. Cosain imoibrithe ina bhfuil tóireadóirí fluaraiseacha ó sholas chun díghrádú a sheachaint.
5. Rialuithe inmheánacha
Cuir rialuithe dearfacha agus diúltacha dea-thréithithe san áireamh, chomh maith le rialú gan teimpléad i ngach imoibriú, agus líne treochta ilphointe titrithe le haghaidh imoibrithe cainníochtúla. Níor cheart go mbeadh an rialú dearfach chomh láidir sin go mbeadh riosca éillithe ann. Cuir rialuithe eastósctha dearfacha agus diúltacha san áireamh agus eastóscadh aigéid núicléasaigh á dhéanamh.
Moltar treoracha soiléire a chur suas i ngach ceann de na limistéir ionas go mbeidh úsáideoirí ar an eolas faoi rialacha iompair. B’fhéidir gur mhaith le saotharlanna diagnóiseacha a bhraithfidh leibhéil an-íseal DNA nó RNA i samplaí cliniciúla an beart slándála breise a ghlacadh chun córais láimhseála aeir ar leithligh a bheith acu le brú aeir beagán dearfach sna seomraí réamh-PCR agus brú aeir beagán diúltach sna seomraí iar-PCR.
Ar deireadh, is cabhair é plean dearbhaithe cáilíochta (QA) a fhorbairt. Ba cheart go mbeadh liostaí de mháistirstoic imoibrithe agus stoic oibre, rialacha maidir le trealamh agus imoibrithe a stóráil, tuairisciú ar thorthaí rialaithe, cláir oiliúna foirne, halgartaim fabhtcheartaithe, agus gníomhartha feabhais nuair is gá san áireamh sa phlean sin.
6. Leabharliosta
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Caibidil 3: Saotharlann qPCR a bhunú. Doiciméad treorach chun uiscí áineasa a thástáil ag baint úsáide as modh qPCR USEPA 1611. Ollscoil Stáit Lansing-Michigan.
Sláinte Phoiblí Shasana, an tSeirbhís Náisiúnta Sláinte (NHS). Caighdeáin na Ríochta Aontaithe maidir le himscrúduithe micribhitheolaíochta: Dea-chleachtas Saotharlainne agus measúnuithe aimpliúcháin mhóilíneacha á ndéanamh. Treoir Cháilíochta. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Saotharlann PCR a bhunú. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Cothabháil rialta lártheifneoirí: glanadh, cothabháil agus díghalrú lártheifneoirí, rótar agus oiriúnaitheoirí (Páipéar bán Uimh. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Dea-Chleachtas Saotharlainne Cliniciúil (GCLP) le haghaidh tástálacha móilíneacha a úsáidtear i saotharlanna diagnóiseacha, In: Akyar I, eagarthóir. Speictrim leathan rialaithe cáilíochta. Rijeka, an Chróit: Intech; 2011: 29–52.
Am an phoist: 16 Iúil 2020
