Molekulêre deteksjemetoaden hawwe de mooglikheid om in grutte hoemannichte nukleïnezuur te produsearjen troch de amplifikaasje fan spoarhoemannichten dy't fûn wurde yn samples. Hoewol dit foardielich is foar it mooglik meitsjen fan gefoelige deteksje, yntrodusearret it ek de mooglikheid fan fersmoarging troch de fersprieding fan amplifikaasje-aerosolen yn 'e laboratoariumomjouwing. By it útfieren fan eksperiminten kinne maatregels nommen wurde om de fersmoarging fan reagentia, laboratoariumapparatuer en wurkbankromte te foarkommen, om't sokke fersmoarging falsk-positive (of falsk-negative) resultaten kin generearje.
Om de kâns op fersmoarging te ferminderjen, moat altyd goede laboratoariumpraktiken tapast wurde. Spesifyk moatte foarsoarchsmaatregels nommen wurde oangeande de folgjende punten:
1. Reagentia behannelje
2. Organisaasje fan wurkromte en apparatuer
3. Gebrûks- en skjinmeitsadvys foar de oanwiisde molekulêre romte
4. Algemien advys oer molekulêre biology
5. Ynterne kontrôles
6. Bibliografy
1. Reagentia behannelje
Sentrifugearje de reagensbuizen koart foardat jo se iepenje om it ûntstean fan aerosolen te foarkommen. Ferdiel de reagens om meardere befriezen en ûntdooien en fersmoarging fan 'e masterstocks te foarkommen. Label en datearje alle reagens- en reaksjebuizen dúdlik en hâld logboeken by fan 'e lot- en batchnûmers fan 'e reagens dy't yn alle eksperiminten brûkt binne. Pipettear alle reagens en samples mei filtertips. Foardat jo se keapje, is it oan te rieden om mei de fabrikant te befestigjen dat de filtertips passe by it merk pipette dat brûkt wurde sil.
2. Organisaasje fan wurkromte en apparatuer
De wurkromte moat sa organisearre wurde dat de wurkstream yn ien rjochting plakfynt, fan skjinne gebieten (foar-PCR) oant smoarge gebieten (post-PCR). De folgjende algemiene foarsoarchsmaatregels sille helpe om de kâns op fersmoarging te ferminderjen. Hawwe aparte oanwiisde keamers, of teminsten fysyk aparte gebieten, foar: mastermix tarieding, nukleïnezuur ekstraksje en DNA-sjabloan tafoeging, amplifikaasje en ôfhanneling fan amplifisearre produkt, en produktanalyse, bygelyks gelelektroforese.
Yn guon omjouwings is it lestich om 4 aparte keamers te hawwen. In mooglike, mar minder winsklike opsje is om de mastermix-tarieding te dwaan yn in opslachgebiet, bygelyks in laminêre streamkast. Yn it gefal fan nestele PCR-amplifikaasje moat de tarieding fan 'e mastermix foar de twadde ronde-reaksje taret wurde yn it 'skjinne' gebiet foar mastermix-tarieding, mar de ynokulaasje mei it primêre PCR-produkt moat dien wurde yn 'e amplifikaasjekeamer, en as it mooglik is yn in spesjaal opslachgebiet (bygelyks in laminêre streamkast).
Elke keamer/gebiet hat in aparte set dúdlik markearre pipetten, filtertips, buisrekken, vortexen, sintrifuges (as relevant), pinnen, generike laboratoariumreagentia, laboratoariumjassen en doazen mei wanten nedich dy't op har respektive wurkstasjons bliuwe. Hannen moatte wosken wurde en wanten en laboratoariumjassen moatte ferfongen wurde by it ferpleatsen tusken de oanwiisde gebieten. Reagentia en apparatuer moatte net fan in smoarch gebiet nei in skjin gebiet ferpleatst wurde. As der in ekstreem gefal ûntstiet wêrby't in reagens of stik apparatuer efterút ferpleatst wurde moat, moat it earst dekontaminearre wurde mei 10% natriumhypochloriet, folge troch it ôf te waskjen mei steryl wetter.
Noat
De 10% natriumhypochlorietoplossing moat alle dagen farsk makke wurde. By gebrûk foar dekontaminaasje moat in minimale kontakttiid fan 10 minuten oanhâlden wurde.
As alternatyf kinne kommersjeel beskikbere produkten dy't validearre binne as DNA-ferneatigjende oerflakdekontaminanten brûkt wurde as lokale feilichheidsoanbefellings it gebrûk fan natriumhypochloriet net tastean of as natriumhypochloriet net geskikt is foar it dekontaminearjen fan de metalen ûnderdielen fan apparatuer.
Ideaallik moatte meiwurkers har hâlde oan de unidireksjonele wurkwize en net op deselde dei fan smoarge gebieten (post-PCR) weromgean nei skjinne gebieten (pre-PCR). Der kinne lykwols gefallen wêze dat dit ûnûntkomber is. As sa'n gefal him foardoet, moat it personiel derfoar soargje dat se de hannen goed waskje, wanten ferfange, de oanwiisde laboratoariumjas brûke en gjin apparatuer ynbringe dy't se wer út 'e keamer nimme wolle, lykas laboratoariumboeken. Sokke kontrôlemaatregels moatte wurde beklamme yn personielstraining oer molekulêre metoaden.
Nei gebrûk moatte wurkbankromten skjinmakke wurde mei 10% natriumhypochloriet (folge troch steryl wetter om oerbleaune bleekmiddel te ferwiderjen), 70% ethanol, of in validearre kommersjeel beskikber DNA-ferneatigjend dekontaminant. Ideaallik moatte ultraviolette (UV) lampen ynstalleare wurde om dekontaminaasje troch bestraling mooglik te meitsjen. It gebrûk fan UV-lampen moat lykwols beheind wurde ta sletten wurkgebieten, bygelyks feilichheidskasten, om de UV-bleatstelling fan it laboratoariumpersoniel te beheinen. Folgje de ynstruksjes fan 'e fabrikant foar it ûnderhâld, fentilaasje en skjinmeitsjen fan UV-lampen om te soargjen dat de lampen effektyf bliuwe.
As 70% ethanol brûkt wurdt ynstee fan natriumhypochloriet, sil bestraling mei UV-ljocht nedich wêze om de dekontaminaasje te foltôgjen.
Meitsje de vortex en sintrifugearje net skjin mei natriumhypochloriet; feie ynstee ôf mei 70% ethanol en stel it bleat oan UV-ljocht, of brûk in kommersjeel DNA-ferneatigjend dekontaminant. Foar morsen, nim kontakt op mei de fabrikant foar fierdere skjinmeitsadvys. As de ynstruksjes fan 'e fabrikant it tastean, moatte pipetten routinematich sterilisearre wurde mei in autoklaaf. As pipetten net autoklaveard wurde kinne, moat it genôch wêze om se skjin te meitsjen mei 10% natriumhypochloriet (folge troch in yngeande ôfveeging mei steryl wetter) of mei in kommersjeel DNA-ferneatigjend dekontaminant folge troch UV-bleatstelling.
Reiniging mei natriumhypochlorit mei in heech persintaazje kin úteinlik pipetteplestik en metalen beskeadigje as it regelmjittich dien wurdt; kontrolearje earst de oanbefellings fan 'e fabrikant. Alle apparatuer moat regelmjittich kalibrearre wurde neffens it troch de fabrikant oanrikkemandearre skema. In oanwiisde persoan moat ferantwurdlik wêze foar it garandearjen dat it kalibraasjeskema neilibbe wurdt, detaillearre logs byhâlden wurde en ûnderhâldslabels dúdlik op apparatuer werjûn wurde.
3. Gebrûks- en skjinmeitsadvys foar de oanwiisde molekulêre romte
Pre-PCR: Reagensalikvotaasje / mastermix tarieding: Dit moat de skjinnste fan alle romten wêze dy't brûkt wurde foar de tarieding fan molekulêre eksperiminten en moat ideaal in oanwiisde laminêre streamkast wêze dy't foarsjoen is fan in UV-ljocht. Monsters, ekstrahearre nukleïnezuur en amplifisearre PCR-produkten meie net yn dit gebiet behannele wurde. Amplifikaasjereagentia moatte yn in friezer (of kuolkast, neffens de oanbefellings fan 'e fabrikant) bewarre wurde yn deselde oanwiisde romte, ideaal neist de laminêre streamkast of it pre-PCR-gebiet. Handschoenen moatte elke kear as jo it pre-PCR-gebiet of de laminêre streamkast yngeane, ferfongen wurde.
It pre-PCR-gebiet of de laminêre streamkast moat foar en nei gebrûk as folget skjinmakke wurde: Feie alle items yn 'e kast ôf, lykas pipetten, tipdoazen, vortex, sintrifuge, buiskekken, pinnen, ensfh. mei 70% ethanol of in kommersjeel DNA-ferneatigjend dekontaminant, en lit it droegje. Yn it gefal fan in sletten wurkgebiet, lykas in laminêre streamkast, stel de kap 30 minuten bleat oan UV-ljocht.
Noat
Stel reagentia net bleat oan UV-ljocht; set se pas yn 'e kast as dy skjin is. As jo reverse transkripsje PCR útfiere, kin it ek nuttich wêze om oerflakken en apparatuer ôf te feegjen mei in oplossing dy't RNases by kontakt ôfbrekt. Dit kin helpe om falsk-negative resultaten troch enzymdegradaasje fan RNA te foarkommen. Nei dekontaminaasje en foar it tarieden fan 'e mastermix moatte de wanten nochris ferfongen wurde, en dan is de kast klear foar gebrûk.
Pre-PCR: Ekstraksje fan nukleïnezuur/tafoeging fan sjabloan:
Nukleïnezuur moat ekstrahearre en behannele wurde yn in twadde oanwiisd gebiet, mei in aparte set pipetten, filtertips, buisrekken, nije wanten, laboratoariumjassen en oare apparatuer. Dit gebiet is ek foar it tafoegjen fan sjabloanen, kontrôles en trendlinen oan 'e mastermixbuizen of -platen. Om fersmoarging fan 'e ekstrahearre nukleïnezuurmonsters dy't analysearre wurde te foarkommen, wurdt it oanrikkemandearre om wanten te wikseljen foardat positive kontrôles of standerts behannele wurde en in aparte set pipetten te brûken. PCR-reagentia en fersterke produkten meie net yn dit gebiet pipetteare wurde. Monsters moatte opslein wurde yn oanwiisde kuolkasten of friezers yn itselde gebiet. De wurkromte foar monsters moat op deselde manier skjinmakke wurde as de mastermixromte.
Post-PCR: Amplifikaasje en ôfhanneling fan it amplifisearre produkt
Dizze oanwiisde romte is foar post-amplifikaasjeprosessen en moat fysyk skieden wêze fan 'e pre-PCR-gebieten. It befettet meastentiids thermocyclers en real-time platfoarms, en ideaal moat it in laminêre streamkast hawwe foar it tafoegjen fan it PCR-produkt fan ronde 1 oan 'e reaksje fan ronde 2, as nestele PCR wurdt útfierd. PCR-reagentia en ekstrahearre nukleïnezuur meie net yn dit gebiet behannele wurde, om't it risiko op fersmoarging heech is. Dit gebiet moat in aparte set handschoenen, laboratoariumjassen, plaat- en buiskekken, pipetten, filtertips, bakken en oare apparatuer hawwe. Buizen moatte sintrifugearre wurde foardat se iepene wurde. De wurkromte foar it sample moat op deselde wize skjinmakke wurde as de mastermixromte.
Post-PCR: Produktanalyse
Dizze keamer is foar apparatuer foar produktdeteksje, lykas gelelektroforesetanks, stroompakketten, UV-transilluminator en it geldokumintaasjesysteem. Dit gebiet moat aparte sets handschoenen, laboratoariumjassen, platen- en buiskekken, pipetten, filtertips, bakken en oare apparatuer hawwe. Gjin oare reagentia meie yn dit gebiet brocht wurde, útsein it laden fan kleurstof, molekulêre marker en agarosegel, en bufferkomponinten. De wurkromte foar samples moat op deselde wize skjinmakke wurde as de mastermixromte.
Wichtige notysje
Ideaallik moatte de pre-PCR-keamers net op deselde dei yngien wurde as der al wurk dien is yn 'e post-PCR-keamers. As dit folslein ûnûntkomber is, soargje der dan foar dat de hannen earst goed wosken wurde en dat spesifike labjassen yn 'e keamers droegen wurde. Labboeken en papierwurk meie net meinommen wurde yn 'e pre-PCR-keamers as se brûkt binne yn 'e post-PCR-keamers; nim as it nedich is dûbele printsjes fan protokollen/sample-ID's, ensfh.
4. Algemien advys oer molekulêre biology
Brûk poeierfrije wanten om assay-ynhibysje te foarkommen. De juste pipetteartechnyk is fan it grutste belang om fersmoarging te ferminderjen. Ferkeard pipettearjen kin liede ta spetterjen by it dosearjen fan floeistoffen en it meitsjen fan aerosolen. Goede praktyk foar korrekt pipettearjen is te finen op de folgjende keppelings: Gilson-hantlieding foar pipettearjen, Anachem-pipettechnykfideo's, Sentrifugearje buizen foar it iepenjen, en iepenje se foarsichtich om spetterjen te foarkommen. Slút de buizen direkt nei gebrûk om de ynfiering fan fersmoarging te foarkommen.
By it útfieren fan meardere reaksjes, meitsje ien mastermix mei mienskiplike reagentia (bygelyks wetter, dNTP's, buffer, primers en enzyme) om it oantal reagensoerdrachten te minimalisearjen en de bedriging fan fersmoarging te ferminderjen. It is oan te rieden om de mastermix op iis of in kâld blok op te setten. It brûken fan in Hot Start-enzym kin helpe om de produksje fan net-spesifike produkten te ferminderjen. Beskermje reagentia dy't fluorescerende probes befetsje tsjin ljocht om degradaasje te foarkommen.
5. Ynterne kontrôles
Nim goed karakterisearre, befêstige positive en negative kontrôles op, tegearre mei in kontrôle sûnder sjabloan yn alle reaksjes, en in mearpunts titrearre trendline foar kwantitative reaksjes. De positive kontrôle moat net sa sterk wêze dat it in fersmoargingsrisiko foarmet. Nim positive en negative ekstraksjekontrôles op by it útfieren fan nukleïnezuurekstraksje.
It is oan te rieden om dúdlike ynstruksjes yn elk fan 'e gebieten te pleatsen, sadat brûkers bewust binne fan gedrachsregels. Diagnostyske laboratoria dy't tige lege nivo's fan DNA of RNA yn klinyske samples detektearje, kinne de ekstra feiligensmaatregel nimme fan it hawwen fan aparte loftbehannelingssystemen mei in lichte positive luchtdruk yn 'e keamers foar de PCR en in lichte negative luchtdruk yn 'e keamers nei de PCR.
Ta beslút is it ûntwikkeljen fan in kwaliteitsfersekeringsplan (QA) nuttich. Sa'n plan moat listen befetsje fan reagentia-masterfoarrieden en wurkfoarrieden, regels foar it opslaan fan kits en reagentia, rapportaazje fan kontrôleresultaten, trainingsprogramma's foar personiel, algoritmen foar probleemoplossing en remediearjende aksjes as nedich.
6. Bibliografy
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Haadstik 3: It opsetten fan in qPCR-laboratoarium. In begeliedingsdokumint foar it testen fan rekreaasjewetters mei USEPA qPCR-metoade 1611. Lansing- Michigan State University.
Public Health England, NHS. UK-noarmen foar mikrobiologyske ûndersiken: Goede laboratoariumpraktyk by it útfieren fan molekulêre amplifikaasje-assays). Kwaliteitsbegelieding. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. It opsetten fan in PCR-laboratoarium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Routineûnderhâld fan sintrifuges: skjinmeitsjen, ûnderhâld en desinfeksje fan sintrifuges, rotors en adapters (Wytboek nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Goede Klinyske Laboratoariumpraktyk (GCLP) foar molekulêr basearre testen brûkt yn diagnostyske laboratoaria, Yn: Akyar I, redakteur. Breed spektra fan kwaliteitskontrôle. Rijeka, Kroaasje: Intech; 2011: 29–52.
Pleatsingstiid: 16 july 2020
