Les méthodes de détection moléculaire permettent de produire un grand volume d'acide nucléique par amplification de traces présentes dans les échantillons. Si cette technique est avantageuse pour une détection sensible, elle introduit également un risque de contamination par la dispersion d'aérosols d'amplification dans l'environnement du laboratoire. Lors des expériences, des mesures doivent être prises pour éviter la contamination des réactifs, du matériel de laboratoire et de l'espace de travail, car une telle contamination peut générer des résultats faussement positifs (ou faussement négatifs).
Afin de réduire les risques de contamination, les bonnes pratiques de laboratoire doivent être appliquées en permanence. Plus précisément, des précautions doivent être prises concernant les points suivants :
1. Manipulation des réactifs
2. Organisation de l'espace de travail et des équipements
3. Conseils d'utilisation et de nettoyage de l'espace moléculaire désigné
4. Conseils généraux en biologie moléculaire
5. Contrôles internes
6. Bibliographie
1. Manipulation des réactifs
Centrifugez brièvement les tubes de réactifs avant ouverture afin d'éviter la formation d'aérosols. Répartissez les réactifs en aliquotes pour éviter les cycles de congélation-décongélation répétés et la contamination des solutions mères. Étiquetez et datez clairement tous les tubes de réactifs et de réactions et tenez un registre des numéros de lot et de série des réactifs utilisés dans toutes les expériences. Pipetez tous les réactifs et échantillons à l'aide d'embouts filtrants. Avant tout achat, il est conseillé de vérifier auprès du fabricant la compatibilité des embouts filtrants avec la marque de pipette utilisée.
2. Organisation de l'espace de travail et des équipements
L'espace de travail doit être organisé de manière à ce que le flux de travail soit unidirectionnel, des zones propres (pré-PCR) aux zones contaminées (post-PCR). Les précautions générales suivantes contribueront à réduire les risques de contamination. Prévoir des salles distinctes, ou au minimum des zones physiquement séparées, pour : la préparation du mélange maître, l'extraction des acides nucléiques et l'ajout de la matrice d'ADN, l'amplification et la manipulation du produit amplifié, et l'analyse du produit, par exemple par électrophorèse sur gel.
Dans certains contextes, disposer de quatre pièces séparées s'avère complexe. Une solution possible, mais moins souhaitable, consiste à réaliser la préparation du mélange maître dans une zone de confinement, par exemple une hotte à flux laminaire. Dans le cas d'une amplification PCR imbriquée, la préparation du mélange maître pour la seconde réaction doit être effectuée dans la zone « propre » dédiée, tandis que l'inoculation avec le produit de la première PCR doit être réalisée dans la salle d'amplification, si possible dans une zone de confinement dédiée (par exemple une hotte à flux laminaire).
Chaque salle/zone doit disposer d'un jeu distinct de pipettes, d'embouts filtrants, de portoirs à tubes, de vortex, de centrifugeuses (le cas échéant), de stylos, de réactifs de laboratoire courants, de blouses et de boîtes de gants, clairement étiquetés et qui resteront à leur poste de travail respectif. Le lavage des mains et le changement de gants et de blouse sont obligatoires lors de tout déplacement entre les zones désignées. Les réactifs et le matériel ne doivent pas être déplacés d'une zone souillée vers une zone propre. Dans le cas exceptionnel où un réactif ou un équipement doit être déplacé en sens inverse, il doit d'abord être décontaminé avec une solution d'hypochlorite de sodium à 10 %, puis essuyé avec de l'eau stérile.
Note
La solution d'hypochlorite de sodium à 10 % doit être préparée quotidiennement. Lors de la décontamination, un temps de contact minimal de 10 minutes doit être respecté.
Alternativement, des produits disponibles dans le commerce et validés comme décontaminants de surface détruisant l'ADN peuvent être utilisés si les recommandations de sécurité locales n'autorisent pas l'utilisation d'hypochlorite de sodium ou si l'hypochlorite de sodium ne convient pas à la décontamination des parties métalliques de l'équipement.
Idéalement, le personnel devrait respecter le principe d'un flux de travail unidirectionnel et ne pas passer des zones souillées (post-PCR) aux zones propres (pré-PCR) le même jour. Toutefois, il peut arriver que cela soit inévitable. Dans ce cas, le personnel doit veiller à se laver soigneusement les mains, à changer de gants, à porter la blouse de laboratoire prévue à cet effet et à ne pas introduire dans la pièce de matériel qu'il souhaitera réutiliser, comme les cahiers de laboratoire. Ces mesures de contrôle doivent être mises en avant lors de la formation du personnel aux méthodes moléculaires.
Après utilisation, les surfaces de travail doivent être nettoyées avec une solution d'hypochlorite de sodium à 10 % (suivie d'eau stérile pour éliminer toute trace de javel), de l'éthanol à 70 % ou un décontaminant commercial validé pour la destruction de l'ADN. Idéalement, des lampes à ultraviolets (UV) devraient être installées pour permettre la décontamination par irradiation. Cependant, l'utilisation des lampes UV doit être limitée aux zones de travail fermées, par exemple les enceintes de sécurité, afin de limiter l'exposition du personnel de laboratoire aux UV. Veuillez respecter les instructions du fabricant concernant l'entretien, la ventilation et le nettoyage des lampes UV afin de garantir leur efficacité.
Si l'on utilise de l'éthanol à 70 % au lieu de l'hypochlorite de sodium, une irradiation aux UV sera nécessaire pour achever la décontamination.
Ne pas nettoyer le vortex et la centrifugeuse avec de l'hypochlorite de sodium ; les essuyer plutôt avec de l'éthanol à 70 % et les exposer aux UV, ou utiliser un décontaminant commercial destructeur d'ADN. En cas de déversement, consulter le fabricant pour obtenir des conseils de nettoyage supplémentaires. Si les instructions du fabricant le permettent, les pipettes doivent être stérilisées régulièrement à l'autoclave. Si l'autoclavage est impossible, un nettoyage avec de l'hypochlorite de sodium à 10 % (suivi d'un rinçage abondant à l'eau stérile) ou avec un décontaminant commercial destructeur d'ADN suivi d'une exposition aux UV devrait suffire.
Le nettoyage à l'hypochlorite de sodium à forte concentration peut endommager à terme les plastiques et les métaux des pipettes s'il est effectué régulièrement ; consultez d'abord les recommandations du fabricant. Tout le matériel doit être étalonné régulièrement selon le calendrier recommandé par le fabricant. Une personne désignée doit veiller au respect du calendrier d'étalonnage, à la tenue de registres détaillés et à l'affichage clair des étiquettes de service sur le matériel.
3. Conseils d'utilisation et de nettoyage de l'espace moléculaire désigné
Préparation pré-PCR : Aliquotage des réactifs / préparation du mélange maître : Cet espace doit être le plus propre de tous ceux utilisés pour la préparation des expériences moléculaires et idéalement une enceinte à flux laminaire dédiée, équipée d’une lampe UV. Les échantillons, les acides nucléiques extraits et les produits PCR amplifiés ne doivent pas être manipulés dans cette zone. Les réactifs d’amplification doivent être conservés au congélateur (ou au réfrigérateur, selon les recommandations du fabricant) dans cet espace, idéalement à proximité de l’enceinte à flux laminaire ou de la zone pré-PCR. Les gants doivent être changés à chaque entrée dans la zone pré-PCR ou l’enceinte à flux laminaire.
La zone de pré-PCR ou l'enceinte à flux laminaire doit être nettoyée avant et après utilisation comme suit : essuyer tous les éléments présents dans l'enceinte (pipettes, boîtes à embouts, vortex, centrifugeuse, portoirs à tubes, stylos, etc.) avec de l'éthanol à 70 % ou un décontaminant commercial détruisant l'ADN, puis laisser sécher. Dans le cas d'un espace de travail clos, comme une enceinte à flux laminaire, exposer la hotte aux UV pendant 30 minutes.
Note
Ne pas exposer les réactifs aux UV ; les introduire dans l’enceinte uniquement lorsque celle-ci est propre. En cas de RT-PCR, il peut être utile de désinfecter les surfaces et le matériel avec une solution inactivant les RNases au contact. Ceci permet d’éviter les faux négatifs dus à la dégradation enzymatique de l’ARN. Après décontamination et avant la préparation du mélange maître, changer de gants une dernière fois ; l’enceinte est alors prête à l’emploi.
Pré-PCR : Extraction d’acide nucléique/ajout de matrice :
L'extraction et la manipulation des acides nucléiques doivent être effectuées dans une zone distincte, à l'aide d'un jeu de pipettes, d'embouts filtrants, de portoirs à tubes, de gants, de blouses et d'équipements propres. Cette zone sert également à l'ajout de la matrice, des contrôles et des courbes de tendance aux tubes ou plaques de mélange maître. Afin d'éviter toute contamination des échantillons d'acides nucléiques extraits et analysés, il est recommandé de changer de gants avant toute manipulation des contrôles positifs ou des standards et d'utiliser un jeu de pipettes distinct. Les réactifs PCR et les produits amplifiés ne doivent pas être pipetés dans cette zone. Les échantillons doivent être conservés dans les réfrigérateurs ou congélateurs prévus à cet effet, situés dans la même zone. Le plan de travail des échantillons doit être nettoyé de la même manière que celui du mélange maître.
Post-PCR : Amplification et manipulation du produit amplifié
Cet espace est dédié aux étapes post-amplification et doit être physiquement séparé des zones pré-PCR. Il contient généralement des thermocycleurs et des plateformes de PCR en temps réel, et idéalement une enceinte à flux laminaire pour l'ajout du produit de la première PCR à la réaction de la seconde, en cas de PCR nichée. Les réactifs de PCR et les acides nucléiques extraits ne doivent pas être manipulés dans cette zone en raison du risque élevé de contamination. Cette zone doit disposer d'un jeu séparé de gants, de blouses de laboratoire, de portoirs pour plaques et tubes, de pipettes, d'embouts filtrants, de bacs et autres équipements. Les tubes doivent être centrifugés avant ouverture. L'espace de travail des échantillons doit être nettoyé de la même manière que l'espace de préparation du mélange maître.
Analyse du produit après PCR
Cette pièce est réservée aux équipements de détection de produits, tels que les cuves d'électrophorèse sur gel, les alimentations électriques, le transilluminateur UV et le système de documentation des gels. Elle doit être équipée de gants, de blouses de laboratoire, de portoirs pour plaques et tubes, de pipettes, de pointes de filtres, de bacs et autres matériels distincts. Aucun autre réactif n'est autorisé dans cette zone, à l'exception du colorant de chargement, du marqueur moléculaire, du gel d'agarose et des composants du tampon. Le plan de travail des échantillons doit être nettoyé de la même manière que celui des mélanges maîtres.
Note importante
Idéalement, il est déconseillé d'entrer dans les salles de pré-PCR le même jour que les salles de post-PCR. Si cela s'avère absolument inévitable, veillez à vous laver soigneusement les mains au préalable et à porter une blouse de laboratoire spécifique. Les cahiers de laboratoire et les documents utilisés dans les salles de post-PCR ne doivent pas y être introduits ; si nécessaire, emportez des copies des protocoles, des identifiants d'échantillons, etc.
4. Conseils généraux en biologie moléculaire
Utilisez des gants sans poudre pour éviter toute inhibition du dosage. Une technique de pipetage correcte est essentielle pour limiter la contamination. Un pipetage incorrect peut entraîner des éclaboussures lors de la distribution de liquides et la formation d'aérosols. Vous trouverez des conseils sur les bonnes pratiques de pipetage aux liens suivants : guide de Gilson sur le pipetage, vidéos sur les techniques de pipetage d'Anachem, centrifugez les tubes avant de les ouvrir et ouvrez-les avec précaution pour éviter les éclaboussures. Refermez les tubes immédiatement après utilisation afin d'éviter toute contamination.
Lors de la réalisation de réactions multiples, préparez un mélange maître contenant les réactifs communs (eau, dNTP, tampon, amorces et enzyme) afin de minimiser les transferts de réactifs et de réduire les risques de contamination. Il est recommandé de conserver le mélange maître sur de la glace ou un bloc réfrigérant. L'utilisation d'une enzyme Hot Start peut contribuer à réduire la production de produits non spécifiques. Protégez de la lumière les réactifs contenant des sondes fluorescentes afin d'éviter leur dégradation.
5. Contrôles internes
Incluez des contrôles positifs et négatifs bien caractérisés et validés, ainsi qu'un contrôle sans matrice, dans toutes les réactions, et une courbe de tendance titrée à plusieurs points pour les réactions quantitatives. Le contrôle positif ne doit pas être trop concentré afin d'éviter tout risque de contamination. Incluez des contrôles d'extraction positifs et négatifs lors de l'extraction d'acides nucléiques.
Il est recommandé d'afficher des instructions claires dans chaque zone afin que les utilisateurs connaissent les règles de conduite. Les laboratoires de diagnostic détectant de très faibles concentrations d'ADN ou d'ARN dans des échantillons cliniques peuvent envisager la mesure de sécurité supplémentaire suivante : l'utilisation de systèmes de traitement de l'air distincts, avec une pression légèrement positive dans les salles de pré-PCR et une pression légèrement négative dans les salles de post-PCR.
Enfin, l'élaboration d'un plan d'assurance qualité (AQ) est utile. Ce plan doit inclure les listes des stocks de réactifs (matériaux et de travail), les règles de stockage des kits et des réactifs, le compte rendu des résultats de contrôle, les programmes de formation du personnel, les algorithmes de dépannage et les mesures correctives à prendre en cas de besoin.
6. Bibliographie
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Santé publique Angleterre, NHS. Normes britanniques pour les analyses microbiologiques : Bonnes pratiques de laboratoire pour la réalisation d’essais d’amplification moléculaire. Guide de qualité. 2013 ;4(4) :1–15.
Mifflin T. Mise en place d'un laboratoire de PCR. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Maintenance courante des centrifugeuses : nettoyage, entretien et désinfection des centrifugeuses, des rotors et des adaptateurs (Livre blanc n° 14). Hambourg : Eppendorf ; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Bonnes pratiques de laboratoire clinique (BPLC) pour les tests moléculaires utilisés dans les laboratoires de diagnostic. Dans : Akyar I, éditeur. Large spectre du contrôle de la qualité. Rijeka, Croatie : Intech ; 2011 : 29-52.
Date de publication : 16 juillet 2020
