بایدها و نبایدهای آزمایش‌های مولکولی

روش‌های تشخیص مولکولی توانایی تولید حجم زیادی از اسید نوکلئیک را از طریق تکثیر مقادیر ناچیز موجود در نمونه‌ها دارند. اگرچه این امر برای امکان‌پذیر کردن تشخیص حساس مفید است، اما احتمال آلودگی از طریق پخش آئروسل‌های تکثیر در محیط آزمایشگاه را نیز ایجاد می‌کند. هنگام انجام آزمایش‌ها، می‌توان اقداماتی را برای جلوگیری از آلودگی معرف‌ها، تجهیزات آزمایشگاهی و فضای میز انجام داد، زیرا چنین آلودگی ممکن است نتایج مثبت کاذب (یا منفی کاذب) ایجاد کند.

برای کمک به کاهش احتمال آلودگی، باید همواره اصول صحیح آزمایشگاهی رعایت شود. به طور خاص، باید اقدامات احتیاطی در مورد نکات زیر انجام شود:

۱. کار با معرف‌ها
۲. سازماندهی فضای کاری و تجهیزات
۳. توصیه‌های مربوط به استفاده و تمیز کردن فضای مولکولی تعیین‌شده
۴. توصیه‌های عمومی زیست‌شناسی مولکولی
۵. کنترل‌های داخلی
۶. کتابشناسی

۱. کار با معرف‌ها

قبل از باز کردن، لوله‌های معرف را به طور خلاصه سانتریفیوژ کنید تا از تولید آئروسل جلوگیری شود. برای جلوگیری از انجماد-ذوب چندگانه و آلودگی ذخایر اصلی، معرف‌ها را به طور جداگانه انتخاب کنید. تمام لوله‌های معرف و واکنش را به طور واضح برچسب‌گذاری و تاریخ‌گذاری کنید و گزارش شماره سری و تعداد دسته معرف‌های مورد استفاده در تمام آزمایش‌ها را نگه دارید. تمام معرف‌ها و نمونه‌ها را با استفاده از سرپیپت‌های فیلتردار با پیپت آزمایش کنید. قبل از خرید، توصیه می‌شود از سازنده تأیید کنید که سرپیپت‌های فیلتردار با برند پیپت مورد استفاده مطابقت دارند.

۲. سازماندهی فضای کاری و تجهیزات

فضای کاری باید طوری سازماندهی شود که جریان کار در یک جهت، از مناطق تمیز (قبل از PCR) به مناطق کثیف (بعد از PCR) انجام شود. اقدامات احتیاطی عمومی زیر به کاهش احتمال آلودگی کمک می‌کند. اتاق‌های جداگانه یا حداقل مناطق فیزیکی جداگانه برای موارد زیر داشته باشید: آماده‌سازی مخلوط اصلی، استخراج اسید نوکلئیک و افزودن الگوی DNA، تکثیر و جابجایی محصول تکثیر شده و تجزیه و تحلیل محصول، به عنوان مثال الکتروفورز ژل.

در برخی شرایط، داشتن ۴ اتاق جداگانه دشوار است. یک گزینه ممکن اما کمتر مطلوب، انجام آماده‌سازی مخلوط اصلی در یک منطقه‌ی محصور، مثلاً یک کابینت جریان آرام، است. در مورد تکثیر PCR تو در تو، آماده‌سازی مخلوط اصلی برای واکنش دور دوم باید در منطقه‌ی «تمیز» برای آماده‌سازی مخلوط اصلی انجام شود، اما تلقیح با محصول PCR اولیه باید در اتاق تکثیر و در صورت امکان در یک منطقه‌ی محصور اختصاصی (مثلاً یک کابینت جریان آرام) انجام شود.

هر اتاق/منطقه به مجموعه‌ای جداگانه از پیپت‌ها، سر صافی‌ها، قفسه‌های لوله، ورتکس‌ها، سانتریفیوژها (در صورت لزوم)، خودکارها، معرف‌های آزمایشگاهی عمومی، روپوش‌های آزمایشگاهی و جعبه‌های دستکش با برچسب‌های واضح نیاز دارد که در محل کار مربوط به خود باقی می‌مانند. هنگام جابجایی بین مناطق تعیین‌شده، دست‌ها باید شسته و دستکش‌ها و روپوش‌های آزمایشگاهی تعویض شوند. معرف‌ها و تجهیزات نباید از یک منطقه کثیف به یک منطقه تمیز منتقل شوند. در صورت بروز موارد شدید که نیاز به جابجایی یک معرف یا قطعه‌ای از تجهیزات به عقب باشد، ابتدا باید با هیپوکلریت سدیم 10٪ آلودگی‌زدایی شود و سپس با آب استریل پاک شود.

توجه داشته باشید

محلول هیپوکلریت سدیم ۱۰٪ باید روزانه و تازه تهیه شود. هنگام استفاده برای ضدعفونی، حداقل زمان تماس ۱۰ دقیقه باید رعایت شود.
از طرف دیگر، اگر توصیه‌های ایمنی محلی اجازه استفاده از هیپوکلریت سدیم را ندهد یا اگر هیپوکلریت سدیم برای آلودگی‌زدایی قطعات فلزی تجهیزات مناسب نباشد، می‌توان از محصولات تجاری موجود که به عنوان ضدعفونی‌کننده‌های سطحی از بین برنده DNA تأیید شده‌اند، استفاده کرد.

در حالت ایده‌آل، کارکنان باید از اصول جریان کاری یک‌طرفه پیروی کنند و در همان روز از مناطق کثیف (بعد از PCR) به مناطق تمیز (قبل از PCR) برنگردند. با این حال، ممکن است مواقعی وجود داشته باشد که این امر اجتناب‌ناپذیر باشد. در چنین مواقعی، پرسنل باید مراقب باشند که دست‌ها را کاملاً بشویند، دستکش‌ها را عوض کنند، از روپوش آزمایشگاهی تعیین‌شده استفاده کنند و هیچ وسیله‌ای را که می‌خواهند دوباره از اتاق خارج کنند، مانند کتاب‌های آزمایشگاهی، با خود نبرند. چنین اقدامات کنترلی باید در آموزش کارکنان در مورد روش‌های مولکولی مورد تأکید قرار گیرد.

پس از استفاده، فضاهای نیمکت باید با هیپوکلریت سدیم ۱۰٪ (و سپس آب استریل برای از بین بردن سفیدکننده باقیمانده)، اتانول ۷۰٪ یا یک ضدعفونی‌کننده‌ی تخریب‌کننده‌ی DNA که به صورت تجاری در دسترس است و اعتبارسنجی شده است، تمیز شوند. در حالت ایده‌آل، لامپ‌های فرابنفش (UV) باید برای امکان ضدعفونی از طریق تابش نصب شوند. با این حال، استفاده از لامپ‌های UV باید به مناطق کاری بسته، مانند کابینت‌های ایمنی، محدود شود تا قرار گرفتن کارکنان آزمایشگاه در معرض اشعه ماوراء بنفش محدود شود. لطفاً برای اطمینان از مؤثر بودن لامپ‌ها، دستورالعمل‌های سازنده را در مورد مراقبت، تهویه و تمیز کردن لامپ UV رعایت کنید.

اگر به جای هیپوکلریت سدیم از اتانول ۷۰٪ استفاده شود، برای تکمیل فرآیند آلودگی‌زدایی، تابش نور فرابنفش مورد نیاز خواهد بود.
ورتکس و سانتریفیوژ را با هیپوکلریت سدیم تمیز نکنید؛ در عوض، با اتانول ۷۰٪ پاک کنید و در معرض نور UV قرار دهید، یا از یک ضدعفونی‌کننده تجاری نابودکننده DNA استفاده کنید. در صورت نشت، برای مشاوره بیشتر در مورد تمیز کردن با سازنده مشورت کنید. در صورت مجاز بودن دستورالعمل‌های سازنده، پیپت‌ها باید به طور معمول با اتوکلاو استریل شوند. اگر پیپت‌ها قابل اتوکلاو نیستند، کافی است آنها را با هیپوکلریت سدیم ۱۰٪ (و سپس با آب استریل کاملاً تمیز کنید) یا با یک ضدعفونی‌کننده تجاری نابودکننده DNA و سپس در معرض اشعه UV قرار دهید.

تمیز کردن با هیپوکلریت سدیم با درصد بالا در نهایت اگر به طور منظم انجام شود، ممکن است به پلاستیک‌ها و فلزات پیپت آسیب برساند؛ ابتدا توصیه‌های سازنده را بررسی کنید. همه تجهیزات باید طبق برنامه توصیه شده توسط سازنده به طور منظم کالیبره شوند. یک فرد تعیین شده باید مسئول اطمینان از رعایت برنامه کالیبراسیون، نگهداری گزارش‌های دقیق و نمایش واضح برچسب‌های سرویس روی تجهیزات باشد.

۳. توصیه‌های مربوط به استفاده و تمیز کردن فضای مولکولی تعیین‌شده

پیش از PCR: جداسازی معرف‌ها / آماده‌سازی مخلوط اصلی: این قسمت باید تمیزترین قسمت از تمام فضاهای مورد استفاده برای آماده‌سازی آزمایش‌های مولکولی باشد و در حالت ایده‌آل باید یک کابینت جریان آرام مجهز به نور UV باشد. نمونه‌ها، اسید نوکلئیک استخراج‌شده و محصولات PCR تکثیرشده نباید در این قسمت جابجا شوند. معرف‌های تکثیر باید در فریزر (یا یخچال، طبق توصیه‌های سازنده) در همان فضای تعیین‌شده، ترجیحاً در کنار کابینت جریان آرام یا قسمت پیش از PCR نگهداری شوند. دستکش‌ها باید هر بار پس از ورود به قسمت پیش از PCR یا کابینت جریان آرام تعویض شوند.

ناحیه پیش از PCR یا کابینت جریان آرام باید قبل و بعد از استفاده به شرح زیر تمیز شود: تمام وسایل داخل کابینت، مانند پیپت‌ها، جعبه‌های نوک، ورتکس، سانتریفیوژ، قفسه‌های لوله، قلم‌ها و غیره را با اتانول 70٪ یا یک ضدعفونی‌کننده تجاری از بین برنده DNA پاک کنید و بگذارید خشک شود. در مورد ناحیه کاری بسته، مانند کابینت جریان آرام، هود را به مدت 30 دقیقه در معرض نور UV قرار دهید.

توجه داشته باشید

معرف‌ها را در معرض نور UV قرار ندهید؛ فقط زمانی که کابینت تمیز است، آنها را به داخل آن منتقل کنید. در صورت انجام PCR رونویسی معکوس، پاک کردن سطوح و تجهیزات با محلولی که RNaseها را در تماس تجزیه می‌کند نیز می‌تواند مفید باشد. این کار می‌تواند به جلوگیری از نتایج منفی کاذب ناشی از تخریب RNA توسط آنزیم کمک کند. پس از ضدعفونی و قبل از تهیه مسترمیکس، دستکش‌ها باید یک بار دیگر تعویض شوند و سپس کابینت آماده استفاده است.

پیش از PCR: استخراج اسید نوکلئیک/اضافه کردن الگو:

اسید نوکلئیک باید در یک منطقه تعیین‌شده دوم، با استفاده از یک مجموعه جداگانه از پیپت‌ها، نوک‌های فیلتر، قفسه‌های لوله، دستکش‌های نو، روپوش‌های آزمایشگاهی و سایر تجهیزات، استخراج و جابجا شود. این منطقه همچنین برای اضافه کردن الگو، کنترل‌ها و خطوط روند به لوله‌ها یا صفحات مسترمیکس است. برای جلوگیری از آلودگی نمونه‌های اسید نوکلئیک استخراج‌شده که مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند، توصیه می‌شود قبل از جابجایی کنترل‌های مثبت یا استانداردها، دستکش‌ها را تعویض کنید و از یک مجموعه جداگانه از پیپت‌ها استفاده کنید. معرف‌های PCR و محصولات تکثیر شده نباید در این منطقه با پیپت شسته شوند. نمونه‌ها باید در یخچال‌ها یا فریزرهای تعیین‌شده در همان منطقه نگهداری شوند. فضای کاری نمونه باید به همان روش فضای مسترمیکس تمیز شود.

پس از PCR: تکثیر و جابجایی محصول تکثیر شده

این فضای تعیین‌شده برای فرآیندهای پس از تکثیر است و باید از نظر فیزیکی از نواحی پیش از PCR جدا باشد. معمولاً شامل ترموسایکلر و پلتفرم‌های زمان واقعی است و در حالت ایده‌آل، در صورت انجام PCR تودرتو، باید یک کابینت جریان آرام برای اضافه کردن محصول PCR دور ۱ به واکنش دور ۲ داشته باشد. واکنشگرهای PCR و اسید نوکلئیک استخراج‌شده نباید در این ناحیه جابجا شوند زیرا خطر آلودگی زیاد است. این ناحیه باید دارای مجموعه‌ای جداگانه از دستکش، روپوش آزمایشگاهی، قفسه‌های پلیت و لوله، پیپت‌ها، سر فیلترها، سطل‌ها و سایر تجهیزات باشد. لوله‌ها باید قبل از باز شدن سانتریفیوژ شوند. فضای کاری نمونه باید به همان روش فضای مخلوط اصلی تمیز شود.

پس از PCR: آنالیز محصول

این اتاق برای تجهیزات تشخیص محصول، مانند مخازن الکتروفورز ژل، پاورپک‌ها، ترانس ایلومیناتور UV و سیستم مستندسازی ژل است. این منطقه باید دارای مجموعه‌های جداگانه‌ای از دستکش، روپوش آزمایشگاهی، قفسه‌های پلیت و تیوب، پیپت‌ها، سر فیلترها، سطل‌ها و سایر تجهیزات باشد. هیچ معرف دیگری را نمی‌توان به این منطقه آورد، به جز رنگ بارگیری، نشانگر مولکولی و ژل آگارز و اجزای بافر. فضای کاری نمونه باید به همان روش فضای مستر میکس تمیز شود.

نکته مهم

در حالت ایده‌آل، اگر قبلاً کاری در اتاق‌های پس از PCR انجام شده است، نباید در همان روز وارد اتاق‌های پیش از PCR شد. اگر این کار کاملاً اجتناب‌ناپذیر است، مطمئن شوید که ابتدا دست‌ها کاملاً شسته شده‌اند و روپوش‌های آزمایشگاهی مخصوص در اتاق‌ها پوشیده شده‌اند. اگر کتاب‌ها و مدارک آزمایشگاهی در اتاق‌های پس از PCR استفاده شده‌اند، نباید آنها را به اتاق‌های پیش از PCR برد؛ در صورت لزوم، از پروتکل‌ها/شناسه‌های نمونه و غیره، نسخه‌های چاپی تکراری تهیه کنید.

۴. توصیه‌های عمومی زیست‌شناسی مولکولی

برای جلوگیری از مهار سنجش، از دستکش‌های بدون پودر استفاده کنید. روش صحیح پیپتینگ برای کاهش آلودگی بسیار مهم است. پیپتینگ نادرست می‌تواند منجر به پاشیدن مایعات هنگام توزیع و ایجاد آئروسل شود. روش‌های مناسب برای پیپتینگ صحیح را می‌توانید در لینک‌های زیر بیابید: راهنمای گیلسون برای پیپتینگ، ویدیوهای تکنیک پیپتینگ آناخم، لوله‌های سانتریفیوژ را قبل از باز کردن باز کنید و آنها را با دقت باز کنید تا از پاشیدن جلوگیری شود. لوله‌ها را بلافاصله پس از استفاده ببندید تا از ورود آلاینده‌ها جلوگیری شود.

هنگام انجام چندین واکنش، یک مسترمیکس حاوی معرف‌های رایج (مثلاً آب، dNTPها، بافر، پرایمر و آنزیم) تهیه کنید تا تعداد انتقال معرف‌ها به حداقل برسد و خطر آلودگی کاهش یابد. توصیه می‌شود مسترمیکس را روی یخ یا بلوک سرد قرار دهید. استفاده از آنزیم Hot Start می‌تواند به کاهش تولید محصولات غیر اختصاصی کمک کند. برای جلوگیری از تخریب، معرف‌های حاوی پروب‌های فلورسنت را از نور محافظت کنید.

۵. کنترل‌های داخلی

کنترل‌های مثبت و منفی تأیید شده و با مشخصات خوب، به همراه یک کنترل بدون الگو در تمام واکنش‌ها، و یک خط روند تیتر شده چند نقطه‌ای برای واکنش‌های کمی را لحاظ کنید. کنترل مثبت نباید آنقدر قوی باشد که خطر آلودگی ایجاد کند. هنگام انجام استخراج اسید نوکلئیک، کنترل‌های استخراج مثبت و منفی را لحاظ کنید.

توصیه می‌شود دستورالعمل‌های واضحی در هر یک از این قسمت‌ها نصب شود تا کاربران از قوانین رفتاری آگاه باشند. آزمایشگاه‌های تشخیصی که سطوح بسیار پایینی از DNA یا RNA را در نمونه‌های بالینی تشخیص می‌دهند، ممکن است بخواهند اقدام امنیتی اضافی مانند داشتن سیستم‌های تهویه مطبوع جداگانه با فشار هوای کمی مثبت در اتاق‌های قبل از PCR و فشار هوای کمی منفی در اتاق‌های بعد از PCR را اتخاذ کنند.

در نهایت، تدوین یک طرح تضمین کیفیت (QA) مفید است. چنین طرحی باید شامل فهرستی از مواد اولیه و مواد در حال کار، قوانین نگهداری کیت‌ها و مواد، گزارش نتایج کنترل، برنامه‌های آموزشی کارکنان، الگوریتم‌های عیب‌یابی و اقدامات اصلاحی در صورت نیاز باشد.

۶. کتابشناسی

اصلان ای، کینزلمن جی، دریلین ای، آناناوا تی، لاوندر جی. فصل ۳: راه‌اندازی آزمایشگاه qPCR. سند راهنمایی برای آزمایش آب‌های تفریحی با استفاده از روش qPCR USEPA 1611. لنسینگ- دانشگاه ایالتی میشیگان.

بهداشت عمومی انگلستان، NHS. استانداردهای بریتانیا برای تحقیقات میکروبیولوژی: شیوه‌های آزمایشگاهی خوب هنگام انجام سنجش‌های تکثیر مولکولی). راهنمای کیفیت. 2013؛4(4):1–15.

میفلین تی. راه‌اندازی آزمایشگاه PCR. پروتکل Cold Spring Harb. 2007;7.

شرودر اس ۲۰۱۳. نگهداری معمول سانتریفیوژها: تمیز کردن، نگهداری و ضدعفونی سانتریفیوژها، روتورها و آداپتورها (گزارش رسمی شماره ۱۴). هامبورگ: اپندورف؛ ۲۰۱۳.

ویانا آر. وی، والیس سی. ال. روش آزمایشگاهی بالینی خوب (GCLP) برای آزمایش‌های مبتنی بر مولکولی مورد استفاده در آزمایشگاه‌های تشخیصی، در: آکیار آی، ویراستار. طیف گسترده‌ای از کنترل کیفیت. رییکا، کرواسی: اینتک؛ 2011: 29–52.