Detekzio molekularreko metodoek azido nukleiko bolumen handia sortzeko gaitasuna dute laginetan aurkitutako arrasto-kantitateen anplifikazio bidez. Detekzio sentikorra ahalbidetzeko onuragarria den arren, kutsaduraren aukera ere sortzen du anplifikazio-aerosolak laborategiko ingurunean barreiatuz. Esperimentuak egiterakoan, neurriak har daitezke erreaktiboak, laborategiko ekipamendua eta mahai-espazioa kutsatzea saihesteko, kutsadura horrek emaitza faltsu-positiboak (edo faltsu-negatiboak) sor baititzake.
Kutsaduraren probabilitatea murrizten laguntzeko, Laborategiko Praktika Onak uneoro aplikatu behar dira. Zehazki, neurriak hartu behar dira honako puntu hauei dagokienez:
1. Erreaktiboen maneiua
2. Lan-eremuaren eta ekipamenduaren antolaketa
3. Molekula-espazio izendatuaren erabilera eta garbiketa aholkuak
4. Biologia molekularreko aholku orokorrak
5. Barne-kontrolak
6. Bibliografia
1. Erreaktiboen maneiua
Ireki aurretik, erreaktiboen hodiak labur zentrifugatu, aerosolak sortzea saihesteko. Erreaktiboak zatitu izozte-desizozte anitzak eta master stocken kutsadura saihesteko. Erreaktibo eta erreakzio hodi guztiak argi eta garbi etiketatu eta datatu, eta esperimentu guztietan erabilitako erreaktiboen lote eta multzo zenbakien erregistroak gorde. Pipetatu erreaktibo eta lagin guztiak iragazki puntak erabiliz. Erosi aurretik, komeni da fabrikatzailearekin baieztatzea iragazki puntak erabiliko den pipetaren markarekin bat datozela.
2. Lan-eremuaren eta ekipamenduaren antolaketa
Lan-eremua antolatu behar da lan-fluxua norabide bakarrean gerta dadin, gune garbietatik (PCR aurretik) gune zikinetara (PCR ondoren). Ondorengo neurri orokorrek kutsadura-arriskua murrizten lagunduko dute. Izan gela bereiziak, edo gutxienez gune fisikoki bereiziak, honako hauetarako: mastermix prestaketa, azido nukleikoak erauztea eta DNA txantiloia gehitzea, anplifikatutako produktuaren anplifikazioa eta manipulazioa, eta produktuaren analisia, adibidez, gel elektroforesia.
Zenbait kokapenetan, 4 gela bereizi edukitzea zaila da. Aukera posible bat, baina ez hain desiragarria, mastermixaren prestaketa edukiontzi-eremu batean egitea da, adibidez, fluxu laminarreko armairu batean. PCR anplifikazio txertatuaren kasuan, bigarren txandako erreakziorako mastermixaren prestaketa mastermixaren prestaketarako 'garbi' eremuan prestatu behar da, baina PCR produktu nagusiarekin egindako inokulazioa anplifikazio-gelan egin behar da, eta ahal bada edukiontzi-eremu dedikatu batean (adibidez, fluxu laminarreko armairu batean).
Gela/eremu bakoitzak pipeta, iragazki-punta, hodi-euskarri, zurrunbilo, zentrifugatzaile (dagokionean), boligrafo, laborategiko erreaktibo generiko, laborategiko bata eta eskularru-kaxa multzo bereizi bat behar du, argi eta garbi etiketatuta, dagokien lan-estazioetan utziko direnak. Eskuak garbitu eta eskularruak eta laborategiko bata aldatu behar dira izendatutako eremuen artean mugitzean. Erreaktiboak eta ekipamendua ez dira eremu zikin batetik eremu garbi batera eraman behar. Muturreko kasuren bat gertatuz gero, non erreaktibo edo ekipamendu zati bat atzerantz mugitu behar den, lehenik % 10eko sodio hipokloritoarekin deskontaminatu behar da, eta ondoren ur esterilarekin garbitu.
Oharra
% 10eko sodio hipokloritoaren disoluzioa egunero prestatu behar da. Deskontaminaziorako erabiltzen denean, gutxienez 10 minutuko kontaktu-denbora errespetatu behar da.
Bestela, DNA suntsitzen duten gainazaleko deskontaminatzaile gisa balioztatutako merkataritzan eskuragarri dauden produktuak erabil daitezke, tokiko segurtasun-gomendioek sodio hipokloritoa erabiltzea baimentzen ez badute edo sodio hipokloritoa ez bada egokia ekipamenduen zati metalikoak deskontaminatzeko.
Idealena litzateke langileek norabide bakarreko lan-fluxuaren etosari eustea eta ez joatea gune zikinetatik (PCR ostekoa) gune garbietara (PCR aurrekoa) egun berean. Hala ere, batzuetan saihestezina izan daiteke hori. Halakoetan, langileek eskuak ondo garbitu, eskularruak aldatu, laborategiko bata erabili eta gelatik atera nahi duten ekipamendurik ez sartu behar dute, hala nola laborategiko liburuak. Kontrol-neurri horiek azpimarratu beharko lirateke langileen metodo molekularrei buruzko prestakuntzan.
Erabili ondoren, mahai-espazioak % 10eko sodio hipokloritoarekin garbitu behar dira (ondoren, ur esterilarekin lixiba hondarra kentzeko), % 70eko etanolarekin edo DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertzial balioztatu batekin. Egokiena, ultramoreen (UV) lanparak jartzea litzateke erradiazio bidezko deskontaminazioa ahalbidetzeko. Hala ere, UV lanparak lan-eremu itxietara mugatu behar dira, adibidez, segurtasun-kabinetetara, laborategiko langileen UV esposizioa mugatzeko. Mesedez, jarraitu fabrikatzailearen argibideak UV lanpararen zainketari, aireztapenari eta garbiketari buruz, lanparak eraginkorrak izaten jarraitzen dutela ziurtatzeko.
Sodio hipokloritoaren ordez % 70eko etanola erabiltzen bada, UV argiarekin irradiatu beharko da deskontaminazioa osatzeko.
Ez garbitu zurrunbiloa eta zentrifugatzailea sodio hipokloritoarekin; horren ordez, garbitu % 70eko etanolarekin eta jarri UV argiaren eraginpean, edo erabili DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertzial bat. Isurien kasuan, kontsultatu fabrikatzailearekin garbiketa aholku gehiago lortzeko. Fabrikatzailearen argibideek baimentzen badute, pipetak autoklabean esterilizatu behar dira ohiko moduan. Pipetak autoklabean ezin badira sartu, nahikoa izan beharko litzateke % 10eko sodio hipokloritoarekin garbitzea (ondoren, ur esterilarekin ondo garbitu) edo DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertzial batekin eta ondoren UV argiaren eraginpean jartzea.
Sodio hipoklorito portzentaje handiko garbiketak pipeten plastikoak eta metalak kaltetu ditzake aldizka egiten bada; egiaztatu lehenik fabrikatzailearen gomendioak. Ekipamendu guztia aldizka kalibratu behar da fabrikatzaileak gomendatutako egutegiaren arabera. Izendatutako pertsona batek arduratu beharko luke kalibrazio-egutegia betetzen dela, erregistro zehatzak mantentzen direla eta zerbitzu-etiketak argi eta garbi erakusten direla ekipamenduan.
3. Molekula-espazio izendatuaren erabilera eta garbiketa aholkuak
Aurre-PCR: Erreaktiboen alikuotatzea / masternash prestatzea: Esperimentu molekularrak prestatzeko erabiltzen diren espazio guztien artean garbiena izan beharko litzateke hau, eta, idealena, UV argia duen fluxu laminarreko armairu bat izatea da. Laginak, erauzitako azido nukleikoa eta anplifikatutako PCR produktuak ez dira eremu honetan maneiatu behar. Anplifikazio-erreaktiboak izozkailuan (edo hozkailuan, fabrikatzailearen gomendioen arabera) gorde behar dira, izendatutako espazio berean, ahal dela fluxu laminarreko armairuaren edo aurre-PCR eremuaren ondoan. Eskularruak aldatu behar dira aurre-PCR eremura edo fluxu laminarreko armairura sartzean.
PCR aurreko eremua edo fluxu laminarreko armairua erabili aurretik eta ondoren honela garbitu behar da: Garbitu armairuko elementu guztiak, adibidez, pipetak, punta-kutxak, zurrunbiloa, zentrifugatzailea, hodi-euskarriak, boligrafoak, etab. % 70eko etanolarekin edo DNA suntsitzen duen deskontaminatzaile komertzial batekin, eta lehortzen utzi. Lan-eremu itxi baten kasuan, adibidez, fluxu laminarreko armairu bat, jarri kanpaia UV argiaren eraginpean 30 minutuz.
Oharra
Ez jarri erreaktiboak UV argiaren eraginpean; sartu armairuan garbi dagoenean bakarrik. Alderantzizko transkripzio PCR egiten bada, lagungarria izan daiteke gainazalak eta ekipamendua RNasak kontaktuan deskonposatzen dituen soluzio batekin garbitzea. Horrek RNAren entzimen degradazioaren ondoriozko emaitza faltsu negatiboak saihesteko balio dezake. Deskontaminazioaren ondoren eta mastermix-a prestatu aurretik, eskularruak berriro aldatu behar dira, eta gero armairua erabiltzeko prest egongo da.
Aurre-PCR: Azido nukleikoaren erauzketa/txantiloiaren gehikuntza:
Azido nukleikoa bigarren gune izendatu batean erauzi eta maneiatu behar da, pipeta multzo bereizi bat, iragazki puntak, hodi-euskarriak, eskularru freskoak, laborategiko bata eta bestelako ekipamendua erabiliz. Gune hau txantiloia, kontrolak eta joera-lerroak mastermix hodiei edo plakei gehitzeko ere balio du. Aztertzen ari diren azido nukleikoen lagin erauziak kutsatzea saihesteko, kontrol positiboak edo estandarrak maneiatu aurretik eskularruak aldatzea eta pipeta multzo bereizi bat erabiltzea gomendatzen da. PCR erreaktiboak eta anplifikatutako produktuak ez dira gune honetan pipeteatu behar. Laginak gune berean dauden hozkailu edo izozkailuetan gorde behar dira. Laginen lan-eremua mastermix gunea bezala garbitu behar da.
PCR ostekoa: Anplifikatutako produktuaren anplifikazioa eta manipulazioa
Espazio hau anplifikazio osteko prozesuetarako da eta PCR aurreko guneetatik fisikoki bereizita egon behar da. Normalean termoziklagailuak eta denbora errealeko plataformak ditu, eta idealena fluxu laminarreko armairu bat izatea litzateke 1. txandako PCR produktua 2. txandako erreakziora gehitzeko, PCR txertatua egiten ari bada. PCR erreaktiboak eta ateratako azido nukleikoa ez dira eremu honetan maneiatu behar, kutsadura arriskua handia baita. Eremu honek eskularru, laborategiko bata, plaka eta hodi euskarri, pipetak, iragazki puntak, ontziak eta bestelako ekipamendu multzo bereizi bat izan behar du. Hodiak zentrifugatu egin behar dira ireki aurretik. Laginaren lan-eremua mastermix espazioa bezala garbitu behar da.
PCR ostekoa: Produktuaren analisia
Gela hau produktuak detektatzeko ekipoetarako da, adibidez, gel elektroforesi tankeak, potentzia-paketeak, UV transiluminatzailea eta gel dokumentazio sistema. Eremu honek eskularru multzo bereiziak, laborategiko bata, plaka eta hodi euskarriak, pipetak, iragazki puntak, ontziak eta bestelako ekipoak izan behar ditu. Ez da beste erreaktiborik eremu honetara eraman behar, kargatzeko koloratzailea, markatzaile molekularra eta agarosa gela, eta buffer osagaiak izan ezik. Laginaren lan-eremua mastermix espazioa bezala garbitu behar da.
Ohar garrantzitsua
Egokiena litzateke PCR aurreko geletara ez sartzea egun berean, baldin eta PCR osteko geletan lana egin bada. Hori guztiz saihestezina bada, ziurtatu eskuak ondo garbitu direla lehenik eta laborategiko bata espezifikoak janzten direla geletan. Laborategiko liburuak eta paperak ez dira PCR aurreko geletara sartu behar PCR osteko geletan erabili badira; beharrezkoa bada, protokoloen/laginen IDen inprimaketa bikoiztuak atera, etab.
4. Biologia molekularreko aholku orokorrak
Erabili hautsik gabeko eskularruak analisi-inhibizioa saihesteko. Pipetatze-teknika zuzena ezinbestekoa da kutsadura murrizteko. Pipetatze okerrak likidoak banatzen direnean zipriztinak eta aerosolak sor ditzake. Pipetatze zuzenerako jardunbide egokiak esteka hauetan aurki daitezke: Gilson pipetatzeko gida, Anachem pipetatze-teknikaren bideoak, Zentrifugatu hodiak ireki aurretik, eta ireki kontu handiz zipriztinak saihesteko. Itxi hodiak erabili ondoren berehala kutsatzaileak sartzea saihesteko.
Erreakzio anitz egitean, prestatu mastermix bat erreaktibo arruntak dituena (adibidez, ura, dNTPak, bufferra, primerrak eta entzima), erreaktiboen transferentzia kopurua minimizatzeko eta kutsaduraren arriskua murrizteko. Gomendagarria da mastermixa izotzean edo bloke hotz batean prestatzea. Hasiera beroko entzima bat erabiltzeak produktu ez-espezifikoen ekoizpena murrizten lagun dezake. Babestu zunda fluoreszenteak dituzten erreaktiboak argitik degradazioa saihesteko.
5. Barne-kontrolak
Sartu ondo karakterizatutako eta baieztatutako kontrol positibo eta negatiboak, erreakzio guztietan txantiloirik gabeko kontrol batekin batera, eta erreakzio kuantitatiboetarako joera-lerro titratu anitzeko bat. Kontrol positiboa ez da hain indartsua izan behar kutsadura-arriskua sortzeko. Sartu erauzketa-kontrol positiboak eta negatiboak azido nukleikoen erauzketa egiterakoan.
Gomendagarria da argibide argiak jartzea gune bakoitzean, erabiltzaileek jokabide-arauak ezagutu ditzaten. Lagin klinikoetan DNA edo RNA maila oso baxuak detektatzen dituzten diagnostiko-laborategiek segurtasun-neurri gehigarri bat hartu nahi izan dezakete: aire-presio positiboa PCR aurreko geletan eta negatiboa PCR osteko geletan aire-presioa bereizita edukitzea.
Azkenik, kalitate bermatzeko (KB) plan bat garatzea lagungarria da. Plan horrek erreaktiboen master stocken eta lan-stocken zerrendak, kitak eta erreaktiboak gordetzeko arauak, kontrol-emaitzen berri ematea, langileen prestakuntza-programak, arazoak konpontzeko algoritmoak eta beharrezkoak diren neurri zuzentzaileak barne hartu beharko lituzke.
6. Bibliografia
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. kapitulua: qPCR laborategi bat ezartzea. USEPA qPCR 1611 metodoa erabiliz aisialdirako urak probatzeko gida-dokumentua. Lansing-Michigan State University.
Ingalaterrako Osasun Publikoa, NHS. Erresuma Batuko mikrobiologia ikerketetarako estandarrak: anplifikazio molekularreko analisiak egiterakoan laborategiko praktika onak). Kalitate Gida. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. PCR laborategi bat ezartzea. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Zentrifugatzaileen ohiko mantentze-lanak: zentrifugatzaileen, errotoreen eta egokitzaileen garbiketa, mantentze-lanak eta desinfekzioa (14. liburu zuria). Hanburgo: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Laborategi diagnostikoetan erabiltzen diren molekula-oinarritutako probetarako Laborategi Klinikoko Praktika Onak (GCLP), In: Akyar I, editorea. Kalitate-kontrolaren espektro zabalak. Rijeka, Kroazia: Intech; 2011: 29–52.
Argitaratze data: 2020ko uztailak 16
