Los métodos de detección molecular permiten generar grandes volúmenes de ácido nucleico mediante la amplificación de cantidades mínimas presentes en las muestras. Si bien esto facilita una detección sensible, también introduce el riesgo de contaminación por la dispersión de aerosoles de amplificación en el laboratorio. Al realizar experimentos, se pueden tomar medidas para evitar la contaminación de reactivos, equipos y superficies de trabajo, ya que dicha contaminación puede generar resultados falsos positivos (o falsos negativos).
Para ayudar a reducir la probabilidad de contaminación, se deben seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio en todo momento. En concreto, se deben tomar precauciones con respecto a los siguientes puntos:
1. Manipulación de reactivos
2. Organización del espacio de trabajo y del equipo
3. Consejos de uso y limpieza para el espacio molecular designado
4. Consejos generales de biología molecular
5. Controles internos
6. Bibliografía
1. Manipulación de reactivos
Centrifugue brevemente los tubos de reactivos antes de abrirlos para evitar la generación de aerosoles. Divida los reactivos en alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación y la contaminación de las soluciones madre. Etiquete y feche claramente todos los tubos de reactivos y de reacción, y mantenga un registro de los lotes y números de lote utilizados en todos los experimentos. Pipetee todos los reactivos y muestras utilizando puntas con filtro. Antes de la compra, se recomienda confirmar con el fabricante que las puntas con filtro son compatibles con la marca de pipeta que se va a utilizar.
2. Organización del espacio de trabajo y del equipo
El espacio de trabajo debe organizarse para garantizar que el flujo de trabajo se produzca en una sola dirección, desde las áreas limpias (pre-PCR) hasta las áreas sucias (post-PCR). Las siguientes precauciones generales ayudarán a reducir el riesgo de contaminación. Disponga de salas separadas o, como mínimo, de áreas físicamente separadas para: la preparación de la mezcla maestra, la extracción de ácidos nucleicos y la adición de la plantilla de ADN, la amplificación y manipulación del producto amplificado, y el análisis del producto, por ejemplo, mediante electroforesis en gel.
En algunos entornos, disponer de cuatro salas separadas resulta complicado. Una opción posible, aunque menos recomendable, es preparar la mezcla maestra en una zona de contención, como una cabina de flujo laminar. En el caso de la amplificación por PCR anidada, la preparación de la mezcla maestra para la segunda ronda de reacción debe realizarse en la zona limpia destinada a la preparación de la mezcla maestra, pero la inoculación con el producto de PCR primario debe llevarse a cabo en la sala de amplificación y, de ser posible, en una zona de contención específica (por ejemplo, una cabina de flujo laminar).
Cada sala/área necesita un juego independiente de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, vórtices, centrífugas (si procede), bolígrafos, reactivos genéricos de laboratorio, batas de laboratorio y cajas de guantes, claramente etiquetados, que permanecerán en sus respectivas estaciones de trabajo. Es obligatorio lavarse las manos y cambiarse los guantes y las batas al desplazarse entre las áreas designadas. Los reactivos y el equipo no deben trasladarse de un área sucia a un área limpia. En caso de que sea necesario trasladar un reactivo o equipo de vuelta a un área contaminada, primero debe descontaminarse con hipoclorito de sodio al 10 % y, a continuación, limpiarse con agua estéril.
Nota
La solución de hipoclorito de sodio al 10% debe prepararse diariamente. Cuando se utilice para la descontaminación, debe respetarse un tiempo de contacto mínimo de 10 minutos.
Como alternativa, se pueden utilizar productos disponibles comercialmente que estén validados como descontaminantes de superficies que destruyen el ADN si las recomendaciones de seguridad locales no permiten el uso de hipoclorito de sodio o si el hipoclorito de sodio no es adecuado para descontaminar las partes metálicas de los equipos.
Idealmente, el personal debería respetar el flujo de trabajo unidireccional y no pasar de zonas sucias (post-PCR) a zonas limpias (pre-PCR) en el mismo día. Sin embargo, puede haber ocasiones en que esto sea inevitable. En tales casos, el personal debe lavarse bien las manos, cambiarse los guantes, usar la bata de laboratorio designada y no introducir ningún material que vayan a utilizar posteriormente, como los cuadernos de laboratorio. Estas medidas de control deben enfatizarse en la formación del personal sobre métodos moleculares.
Tras su uso, las superficies de trabajo deben limpiarse con hipoclorito de sodio al 10 % (seguido de agua estéril para eliminar los restos de lejía), etanol al 70 % o un descontaminante comercial validado que destruya el ADN. Idealmente, deberían instalarse lámparas ultravioleta (UV) para permitir la descontaminación por irradiación. Sin embargo, el uso de lámparas UV debe restringirse a áreas de trabajo cerradas, como cabinas de seguridad, para limitar la exposición del personal de laboratorio a la radiación UV. Siga las instrucciones del fabricante para el cuidado, la ventilación y la limpieza de las lámparas UV a fin de garantizar su eficacia.
Si se utiliza etanol al 70% en lugar de hipoclorito de sodio, será necesaria la irradiación con luz ultravioleta para completar la descontaminación.
No limpie el vórtice ni la centrífuga con hipoclorito de sodio; en su lugar, límpielos con etanol al 70 % y expóngalos a luz ultravioleta, o utilice un descontaminante comercial que destruya el ADN. En caso de derrames, consulte al fabricante para obtener más información sobre la limpieza. Si las instrucciones del fabricante lo permiten, esterilice las pipetas periódicamente en autoclave. Si no es posible esterilizarlas en autoclave, bastará con limpiarlas con hipoclorito de sodio al 10 % (seguido de una limpieza exhaustiva con agua estéril) o con un descontaminante comercial que destruya el ADN, seguido de exposición a luz ultravioleta.
La limpieza con hipoclorito de sodio de alta concentración puede dañar las pipetas de plástico y metal si se realiza con frecuencia; consulte primero las recomendaciones del fabricante. Todos los equipos deben calibrarse periódicamente según el programa recomendado por el fabricante. Una persona designada debe ser responsable de garantizar el cumplimiento del programa de calibración, el mantenimiento de registros detallados y la correcta visualización de las etiquetas de servicio en los equipos.
3. Consejos de uso y limpieza para el espacio molecular designado
Pre-PCR: Preparación de alícuotas de reactivos/mezcla maestra: Este debe ser el espacio más limpio de todos los utilizados para la preparación de experimentos moleculares e idealmente debería ser una cabina de flujo laminar equipada con luz UV. Las muestras, el ácido nucleico extraído y los productos de PCR amplificados no deben manipularse en esta área. Los reactivos de amplificación deben conservarse en un congelador (o refrigerador, según las recomendaciones del fabricante) en el mismo espacio designado, idealmente junto a la cabina de flujo laminar o el área de pre-PCR. Los guantes deben cambiarse cada vez que se entre en el área de pre-PCR o en la cabina de flujo laminar.
El área previa a la PCR o la cabina de flujo laminar debe limpiarse antes y después de su uso de la siguiente manera: Limpie todos los elementos de la cabina (pipetas, cajas de puntas, vórtex, centrífuga, gradillas para tubos, bolígrafos, etc.) con etanol al 70 % o un desinfectante comercial que destruya el ADN y deje secar. En el caso de un área de trabajo cerrada, como una cabina de flujo laminar, exponga la campana a luz ultravioleta durante 30 minutos.
Nota
No exponga los reactivos a la luz ultravioleta; trasládelos a la cabina solo una vez que esté limpia. Si realiza una RT-PCR, también puede ser útil limpiar las superficies y el equipo con una solución que descomponga las RNasas por contacto. Esto puede ayudar a evitar resultados falsos negativos debidos a la degradación enzimática del ARN. Después de la descontaminación y antes de preparar la mezcla maestra, cámbiese los guantes una vez más; entonces la cabina estará lista para usar.
Pre-PCR: Extracción de ácido nucleico/adición de plantilla:
El ácido nucleico debe extraerse y manipularse en una segunda área designada, utilizando un juego de pipetas, puntas de filtro, gradillas para tubos, guantes nuevos, batas de laboratorio y demás equipo, todo independiente. Esta área también se destina a la adición de plantillas, controles y líneas de tendencia a los tubos o placas de la mezcla maestra. Para evitar la contaminación de las muestras de ácido nucleico extraídas que se analizan, se recomienda cambiar los guantes antes de manipular los controles positivos o estándares y utilizar un juego de pipetas independiente. Los reactivos de PCR y los productos amplificados no deben pipetearse en esta área. Las muestras deben almacenarse en refrigeradores o congeladores designados en la misma área. El área de trabajo de las muestras debe limpiarse de la misma manera que el área de la mezcla maestra.
Post-PCR: Amplificación y manipulación del producto amplificado
Este espacio designado se utiliza para los procesos posteriores a la amplificación y debe estar físicamente separado de las áreas previas a la PCR. Generalmente contiene termocicladores y plataformas de PCR en tiempo real, e idealmente debería contar con una cabina de flujo laminar para añadir el producto de la primera ronda de PCR a la reacción de la segunda ronda, si se realiza una PCR anidada. Los reactivos de PCR y el ácido nucleico extraído no deben manipularse en esta área, ya que el riesgo de contaminación es alto. Esta área debe contar con un juego independiente de guantes, batas de laboratorio, gradillas para placas y tubos, pipetas, puntas de filtro, contenedores y demás equipo. Los tubos deben centrifugarse antes de abrirlos. El área de trabajo de muestras debe limpiarse de la misma manera que el área de mezcla maestra.
Post-PCR: Análisis del producto
Esta sala está destinada al equipo de detección de productos, como tanques de electroforesis en gel, fuentes de alimentación, transiluminador UV y el sistema de documentación de geles. En esta área se deben usar guantes, batas de laboratorio, gradillas para placas y tubos, pipetas, puntas de filtro, contenedores y demás equipo. No se permite introducir otros reactivos en esta área, excepto el colorante de carga, el marcador molecular, el gel de agarosa y los componentes del tampón. El área de trabajo de muestras debe limpiarse de la misma manera que el área de preparación de la mezcla maestra.
Nota importante
Idealmente, no se debe entrar en las salas de pre-PCR el mismo día si ya se ha trabajado en las salas de post-PCR. Si esto es inevitable, asegúrese de lavarse bien las manos previamente y de usar batas de laboratorio específicas. No se deben llevar cuadernos de laboratorio ni documentación a las salas de pre-PCR si se han utilizado en las salas de post-PCR; si es necesario, lleve copias impresas de los protocolos, identificadores de muestras, etc.
4. Consejos generales de biología molecular
Utilice guantes sin polvo para evitar la inhibición del ensayo. Una técnica de pipeteo correcta es fundamental para reducir la contaminación. Un pipeteo incorrecto puede provocar salpicaduras al dispensar líquidos y la formación de aerosoles. Puede encontrar buenas prácticas para un pipeteo correcto en los siguientes enlaces: Guía de pipeteo de Gilson, vídeos sobre la técnica de pipeteo de Anachem, centrifugar los tubos antes de abrirlos y abrirlos con cuidado para evitar salpicaduras. Cierre los tubos inmediatamente después de su uso para evitar la introducción de contaminantes.
Al realizar múltiples reacciones, prepare una mezcla maestra con reactivos comunes (p. ej., agua, dNTP, tampón, cebadores y enzima) para minimizar las transferencias de reactivos y reducir el riesgo de contaminación. Se recomienda mantener la mezcla maestra en hielo o en un bloque frío. El uso de una enzima de inicio en caliente puede ayudar a reducir la producción de productos inespecíficos. Proteja los reactivos que contengan sondas fluorescentes de la luz para evitar su degradación.
5. Controles internos
Incluya controles positivos y negativos bien caracterizados y confirmados, junto con un control sin plantilla en todas las reacciones, y una línea de tendencia titulada en varios puntos para las reacciones cuantitativas. El control positivo no debe ser tan fuerte como para representar un riesgo de contaminación. Incluya controles de extracción positivos y negativos al realizar la extracción de ácidos nucleicos.
Se recomienda colocar instrucciones claras en cada área para que los usuarios conozcan las normas de conducta. Los laboratorios de diagnóstico que detecten niveles muy bajos de ADN o ARN en muestras clínicas podrían adoptar la medida de seguridad adicional de contar con sistemas de ventilación independientes, con una presión ligeramente positiva en las salas previas a la PCR y una presión ligeramente negativa en las salas posteriores a la PCR.
Por último, resulta útil desarrollar un plan de garantía de calidad (GC). Dicho plan debe incluir listas de stocks maestros y de trabajo de reactivos, normas para el almacenamiento de kits y reactivos, informes de resultados de control, programas de formación del personal, algoritmos de resolución de problemas y medidas correctivas cuando sea necesario.
6. Bibliografía
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Fecha de publicación: 16 de julio de 2020
