Molekularbiologische Nachweismethoden ermöglichen die Herstellung großer Mengen an Nukleinsäure durch Amplifikation von Spurenmengen in Proben. Dies ist zwar vorteilhaft für den sensitiven Nachweis, birgt aber auch das Risiko einer Kontamination durch die Verbreitung von Amplifikationsaerosolen im Labor. Bei der Durchführung von Experimenten können Maßnahmen ergriffen werden, um die Kontamination von Reagenzien, Laborgeräten und Arbeitsflächen zu vermeiden, da eine solche Kontamination zu falsch-positiven (oder falsch-negativen) Ergebnissen führen kann.
Um das Risiko einer Kontamination zu verringern, sollten die Grundsätze der Guten Laborpraxis (GLP) stets eingehalten werden. Insbesondere sollten in Bezug auf folgende Punkte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden:
1. Umgang mit Reagenzien
2. Organisation des Arbeitsplatzes und der Ausrüstung
3. Hinweise zur Verwendung und Reinigung des vorgesehenen Molekülraums
4. Allgemeine Hinweise zur Molekularbiologie
5. Interne Kontrollen
6. Bibliographie
1. Umgang mit Reagenzien
Reagenzröhrchen vor dem Öffnen kurz zentrifugieren, um die Bildung von Aerosolen zu vermeiden. Reagenzien aliquotieren, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen sowie die Kontamination von Stammlösungen zu verhindern. Alle Reagenz- und Reaktionsröhrchen deutlich beschriften und datieren. Chargen- und Losnummern der in allen Experimenten verwendeten Reagenzien dokumentieren. Alle Reagenzien und Proben mit Filterspitzen pipettieren. Vor dem Kauf empfiehlt es sich, beim Hersteller zu prüfen, ob die Filterspitzen mit der verwendeten Pipette kompatibel sind.
2. Organisation des Arbeitsplatzes und der Ausrüstung
Der Arbeitsbereich sollte so organisiert sein, dass der Arbeitsfluss in eine Richtung verläuft, von sauberen Bereichen (vor der PCR) zu kontaminierten Bereichen (nach der PCR). Die folgenden allgemeinen Vorsichtsmaßnahmen tragen dazu bei, das Kontaminationsrisiko zu verringern: Verwenden Sie separate Räume oder zumindest räumlich getrennte Bereiche für: die Herstellung der Mastermix, die Nukleinsäureextraktion und die Zugabe der DNA-Vorlage, die Amplifikation und die Handhabung des amplifizierten Produkts sowie die Produktanalyse, z. B. mittels Gelelektrophorese.
In manchen Umgebungen ist die Bereitstellung von vier separaten Räumen schwierig. Eine mögliche, aber weniger wünschenswerte Alternative ist die Herstellung der Mastermix-Lösung in einem Sicherheitsbereich, z. B. in einer Laminar-Flow-Box. Bei der Nested-PCR-Amplifikation sollte die Mastermix-Lösung für die zweite Reaktionsrunde im Reinraum für die Mastermix-Herstellung vorbereitet werden, die Inokulation mit dem primären PCR-Produkt jedoch im Amplifikationsraum und möglichst in einem separaten Sicherheitsbereich (z. B. einer Laminar-Flow-Box) erfolgen.
Jeder Raum/Bereich benötigt einen separaten Satz deutlich beschrifteter Pipetten, Filterspitzen, Röhrchengestelle, Vortex-Mischer, Zentrifugen (falls erforderlich), Stifte, Standard-Laborreagenzien, Laborkittel und Handschuhboxen, die an den jeweiligen Arbeitsplätzen verbleiben. Beim Wechsel zwischen den Bereichen müssen die Hände gewaschen und Handschuhe sowie Laborkittel gewechselt werden. Reagenzien und Geräte dürfen nicht von einem kontaminierten in einen sauberen Bereich verbracht werden. Sollte in Ausnahmefällen ein Reagenz oder ein Gerät zurückgebracht werden müssen, muss es zuvor mit 10%iger Natriumhypochloritlösung desinfiziert und anschließend mit sterilem Wasser abgewischt werden.
Notiz
Die 10%ige Natriumhypochloritlösung muss täglich frisch zubereitet werden. Bei der Anwendung zur Dekontamination ist eine Mindesteinwirkzeit von 10 Minuten einzuhalten.
Alternativ können im Handel erhältliche Produkte verwendet werden, die als DNA-zerstörende Oberflächendesinfektionsmittel validiert sind, wenn lokale Sicherheitsempfehlungen die Verwendung von Natriumhypochlorit nicht zulassen oder wenn Natriumhypochlorit nicht zur Dekontamination der metallischen Teile von Geräten geeignet ist.
Idealerweise sollten die Mitarbeiter den unidirektionalen Arbeitsablauf einhalten und nicht am selben Tag von kontaminierten Bereichen (nach der PCR) zurück in saubere Bereiche (vor der PCR) wechseln. Es kann jedoch Situationen geben, in denen dies unvermeidbar ist. In solchen Fällen müssen die Mitarbeiter darauf achten, sich gründlich die Hände zu waschen, die Handschuhe zu wechseln, den vorgesehenen Laborkittel zu tragen und keine Geräte, die sie später wieder aus dem Raum mitnehmen möchten (z. B. Laborbücher), einzubringen. Diese Kontrollmaßnahmen sollten in den Mitarbeiterschulungen zu molekularbiologischen Methoden besonders hervorgehoben werden.
Nach Gebrauch sollten Arbeitsflächen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung (gefolgt von sterilem Wasser, um Bleichmittelreste zu entfernen), 70%igem Ethanol oder einem validierten, handelsüblichen DNA-zerstörenden Desinfektionsmittel gereinigt werden. Idealerweise sollten UV-Lampen zur Desinfektion durch Bestrahlung eingesetzt werden. Der Einsatz von UV-Lampen sollte jedoch auf geschlossene Arbeitsbereiche, z. B. Sicherheitswerkbänke, beschränkt werden, um die UV-Belastung des Laborpersonals zu minimieren. Bitte beachten Sie die Herstellerangaben zur Pflege, Belüftung und Reinigung der UV-Lampen, um deren Wirksamkeit zu gewährleisten.
Bei Verwendung von 70%igem Ethanol anstelle von Natriumhypochlorit ist eine Bestrahlung mit UV-Licht erforderlich, um die Dekontamination abzuschließen.
Vortexmischer und Zentrifuge dürfen nicht mit Natriumhypochlorit gereinigt werden. Stattdessen mit 70%igem Ethanol abwischen und UV-Licht aussetzen oder ein handelsübliches DNA-zerstörendes Desinfektionsmittel verwenden. Bei Verschüttungen den Hersteller um weitere Reinigungshinweise bitten. Sofern die Herstellerangaben dies zulassen, sollten Pipetten routinemäßig im Autoklaven sterilisiert werden. Ist eine Autoklavierung nicht möglich, genügt die Reinigung mit 10%igem Natriumhypochlorit (gefolgt von gründlichem Abwischen mit sterilem Wasser) oder mit einem handelsüblichen DNA-zerstörenden Desinfektionsmittel und anschließender UV-Bestrahlung.
Die Reinigung mit hochprozentigem Natriumhypochlorit kann bei regelmäßiger Anwendung die Kunststoff- und Metallteile von Pipetten beschädigen; beachten Sie daher unbedingt die Empfehlungen des Herstellers. Alle Geräte müssen regelmäßig gemäß den Herstellervorgaben kalibriert werden. Eine benannte Person sollte dafür verantwortlich sein, dass der Kalibrierungsplan eingehalten, detaillierte Protokolle geführt und die Servicehinweise gut sichtbar an den Geräten angebracht werden.
3. Hinweise zur Verwendung und Reinigung des vorgesehenen Molekülraums
Prä-PCR: Reagenzienaliquotierung / Mastermix-Herstellung: Dieser Bereich sollte der sauberste aller für die Vorbereitung molekularbiologischer Experimente genutzten Räume sein und idealerweise eine separate Laminar-Flow-Box mit UV-Licht sein. Proben, extrahierte Nukleinsäuren und amplifizierte PCR-Produkte dürfen in diesem Bereich nicht gehandhabt werden. Amplifikationsreagenzien sollten im selben Bereich, idealerweise neben der Laminar-Flow-Box oder dem Prä-PCR-Bereich, in einem Gefrierschrank (oder Kühlschrank gemäß Herstellerangaben) aufbewahrt werden. Beim Betreten des Prä-PCR-Bereichs oder der Laminar-Flow-Box müssen die Handschuhe jedes Mal gewechselt werden.
Der Bereich für die PCR-Vorbereitung bzw. die Laminar-Flow-Box sollte vor und nach Gebrauch wie folgt gereinigt werden: Wischen Sie alle Gegenstände in der Box, z. B. Pipetten, Pipettenspitzenboxen, Vortex-Mischer, Zentrifuge, Röhrchengestelle, Stifte usw., mit 70%igem Ethanol oder einem handelsüblichen DNA-zerstörenden Desinfektionsmittel ab und lassen Sie sie trocknen. Bei einem geschlossenen Arbeitsbereich, z. B. einer Laminar-Flow-Box, bestrahlen Sie die Haube 30 Minuten lang mit UV-Licht.
Notiz
Reagenzien dürfen keinem UV-Licht ausgesetzt werden; sie dürfen erst in den Schrank gestellt werden, wenn dieser gereinigt ist. Bei der Durchführung einer Reverse-Transkriptase-PCR kann es hilfreich sein, Oberflächen und Geräte mit einer Lösung abzuwischen, die RNasen bei Kontakt abbaut. Dies kann dazu beitragen, falsch-negative Ergebnisse durch enzymatischen RNA-Abbau zu vermeiden. Nach der Dekontamination und vor der Zubereitung der Mastermix sollten die Handschuhe erneut gewechselt werden; anschließend ist der Schrank einsatzbereit.
Prä-PCR: Nukleinsäureextraktion/Template-Zugabe:
Nukleinsäuren müssen in einem separaten Bereich extrahiert und gehandhabt werden. Hierfür sind separate Pipetten, Filterspitzen, Röhrchengestelle, frische Handschuhe, Laborkittel und weitere Ausrüstung zu verwenden. In diesem Bereich werden auch Template, Kontrollen und Trendlinien zu den Mastermix-Röhrchen oder -Platten hinzugefügt. Um eine Kontamination der zu analysierenden Nukleinsäureproben zu vermeiden, wird empfohlen, vor der Handhabung von Positivkontrollen oder Standards die Handschuhe zu wechseln und separate Pipetten zu verwenden. PCR-Reagenzien und amplifizierte Produkte dürfen in diesem Bereich nicht pipettiert werden. Die Proben sind in den dafür vorgesehenen Kühl- oder Gefrierschränken im selben Bereich zu lagern. Der Probenarbeitsbereich ist genauso zu reinigen wie der Mastermix-Bereich.
Nach der PCR: Amplifikation und Handhabung des amplifizierten Produkts
Dieser Bereich dient der Nachbearbeitung der Amplifikationsprozesse und sollte räumlich von den Bereichen vor der PCR getrennt sein. Er enthält üblicherweise Thermocycler und Echtzeit-PCR-Plattformen und sollte idealerweise über eine Laminar-Flow-Box verfügen, um das PCR-Produkt der ersten Runde der Reaktion der zweiten Runde zuzuführen, falls eine Nested-PCR durchgeführt wird. PCR-Reagenzien und extrahierte Nukleinsäuren dürfen in diesem Bereich nicht gehandhabt werden, da ein hohes Kontaminationsrisiko besteht. Für diesen Bereich sollten separate Handschuhe, Laborkittel, Platten- und Röhrchengestelle, Pipetten, Filterspitzen, Behälter und weitere Ausrüstung bereitstehen. Röhrchen müssen vor dem Öffnen zentrifugiert werden. Der Probenarbeitsbereich sollte auf die gleiche Weise wie der Mastermix-Bereich gereinigt werden.
Post-PCR: Produktanalyse
Dieser Raum dient der Aufbewahrung von Geräten zur Produktdetektion, z. B. Gelelektrophoresekammern, Netzteilen, UV-Transilluminator und dem Geldokumentationssystem. Für diesen Bereich sind separate Sätze Handschuhe, Laborkittel, Platten- und Röhrchengestelle, Pipetten, Filterspitzen, Behälter und weitere Geräte bereitzustellen. Ausgenommen hiervon sind Ladepuffer, Molekulargewichtsmarker, Agarosegel und Pufferkomponenten. Der Probenarbeitsbereich ist analog zum Mastermix-Bereich zu reinigen.
Wichtiger Hinweis
Idealerweise sollten die Prä-PCR-Räume nicht am selben Tag betreten werden, an dem bereits in den Post-PCR-Räumen gearbeitet wurde. Ist dies jedoch unumgänglich, ist darauf zu achten, dass die Hände zuvor gründlich gewaschen und in den Räumen spezielle Laborkittel getragen werden. Laborbücher und -unterlagen dürfen nicht in die Prä-PCR-Räume mitgenommen werden, wenn sie in den Post-PCR-Räumen verwendet wurden; gegebenenfalls sind Kopien von Protokollen/Proben-IDs usw. anzufertigen.
4. Allgemeine Hinweise zur Molekularbiologie
Verwenden Sie puderfreie Handschuhe, um eine Hemmung der Assays zu vermeiden. Die korrekte Pipettiertechnik ist entscheidend für die Reduzierung von Kontaminationen. Falsches Pipettieren kann beim Abgeben von Flüssigkeiten zu Spritzern und zur Bildung von Aerosolen führen. Hinweise zur korrekten Pipettiertechnik finden Sie unter den folgenden Links: Gilson-Leitfaden zum Pipettieren, Anachem-Videos zur Pipettiertechnik. Zentrifugenröhrchen vor dem Öffnen prüfen und vorsichtig öffnen, um Spritzer zu vermeiden. Röhrchen nach Gebrauch sofort wieder verschließen, um die Einschleppung von Verunreinigungen zu verhindern.
Bei der Durchführung mehrerer Reaktionen sollte eine Mastermix-Lösung mit den gemeinsamen Reagenzien (z. B. Wasser, dNTPs, Puffer, Primer und Enzym) vorbereitet werden, um die Anzahl der Reagenzientransfers zu minimieren und das Kontaminationsrisiko zu verringern. Es wird empfohlen, die Mastermix-Lösung auf Eis oder einem Kühlblock vorzubereiten. Die Verwendung eines Hot-Start-Enzyms kann die Bildung unspezifischer Produkte reduzieren. Reagenzien mit Fluoreszenzsonden sollten vor Licht geschützt werden, um deren Abbau zu verhindern.
5. Interne Kontrollen
Führen Sie in allen Reaktionen gut charakterisierte, bestätigte Positiv- und Negativkontrollen sowie eine Negativkontrolle ohne Template durch und verwenden Sie für quantitative Reaktionen eine mehrpunktige Titrationskurve. Die Positivkontrolle sollte nicht so stark sein, dass sie ein Kontaminationsrisiko darstellt. Führen Sie bei der Nukleinsäureextraktion Positiv- und Negativkontrollen durch.
Es wird empfohlen, in jedem Bereich klare Anweisungen auszuhängen, damit die Nutzer die Verhaltensregeln kennen. Diagnostische Labore, die sehr geringe Mengen an DNA oder RNA in klinischen Proben nachweisen, sollten als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme separate Lüftungssysteme mit leichtem Überdruck in den Prä-PCR-Räumen und leichtem Unterdruck in den Post-PCR-Räumen einsetzen.
Abschließend ist die Entwicklung eines Qualitätssicherungsplans (QS-Plan) hilfreich. Ein solcher Plan sollte Listen der Reagenzien-Stammbestände und Arbeitsbestände, Regeln für die Lagerung von Kits und Reagenzien, die Berichterstattung über Kontrollergebnisse, Mitarbeiterschulungsprogramme, Algorithmen zur Fehlerbehebung und gegebenenfalls Korrekturmaßnahmen enthalten.
6. Bibliographie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Einrichtung eines qPCR-Labors. Ein Leitfaden für die Untersuchung von Badegewässern mit der USEPA-qPCR-Methode 1611. Lansing – Michigan State University.
Public Health England, NHS. Britische Standards für mikrobiologische Untersuchungen: Gute Laborpraxis bei der Durchführung molekularer Amplifikationsassays. Qualitätsleitfaden. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Einrichtung eines PCR-Labors. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Routinemäßige Wartung von Zentrifugen: Reinigung, Wartung und Desinfektion von Zentrifugen, Rotoren und Adaptern (Weißbuch Nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Gute klinische Laborpraxis (GCLP) für molekularbiologische Tests in diagnostischen Laboren. In: Akyar I (Hrsg.). Breites Spektrum der Qualitätskontrolle. Rijeka, Kroatien: Intech; 2011: 29–52.
Veröffentlichungsdatum: 16. Juli 2020
