ما يجب وما لا يجب فعله في الاختبارات الجزيئية

تتميز طرق الكشف الجزيئي بالقدرة على إنتاج كميات كبيرة من الأحماض النووية من خلال تضخيم كميات ضئيلة موجودة في العينات. ورغم فائدة هذا الإجراء في تمكين الكشف الدقيق، إلا أنه يُتيح أيضًا إمكانية التلوث من خلال انتشار رذاذ التضخيم في بيئة المختبر. عند إجراء التجارب، يمكن اتخاذ تدابير لتجنب تلوث الكواشف ومعدات المختبر ومساحة العمل، إذ قد يؤدي هذا التلوث إلى نتائج إيجابية خاطئة (أو سلبية خاطئة).

للمساعدة في تقليل احتمالية التلوث، ينبغي اتباع ممارسات المختبرات الجيدة باستمرار. وتحديدًا، ينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة فيما يتعلق بالنقاط التالية:

1. التعامل مع الكواشف
2. تنظيم مساحة العمل والمعدات
3. نصائح الاستخدام والتنظيف للمساحة الجزيئية المخصصة
4. نصائح عامة في علم الأحياء الجزيئي
5. الضوابط الداخلية
6. قائمة المراجع

1. التعامل مع الكواشف

قم بطرد أنابيب الكواشف مركزيًا لفترة وجيزة قبل فتحها لتجنب تكوّن الهباء الجوي. استخدم الكواشف على شكل أجزاء لتجنب تكرار التجمد والذوبان وتلوث المخزون الرئيسي. ضع ملصقات واضحة وتاريخًا على جميع أنابيب الكواشف والتفاعلات، واحتفظ بسجلات لأرقام دفعات الكواشف المستخدمة في جميع التجارب. استخدم ماصة لإخراج جميع الكواشف والعينات باستخدام رؤوس الترشيح. قبل الشراء، يُنصح بالتأكد من الشركة المصنعة أن رؤوس الترشيح تناسب ماركة الماصة المستخدمة.

2. تنظيم مساحة العمل والمعدات

يجب تنظيم مساحة العمل لضمان سير العمل في اتجاه واحد، من المناطق النظيفة (قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل) إلى المناطق المتسخة (بعده). ستساعد الاحتياطات العامة التالية على تقليل احتمالية التلوث. خصص غرفًا منفصلة، ​​أو على الأقل مناطق منفصلة ماديًا، لتحضير الخلطة الرئيسية، واستخلاص الأحماض النووية وإضافة قالب الحمض النووي، وتضخيم المنتج المُضخّم ومعالجته، وتحليل المنتج، مثل الرحلان الكهربائي للهلام.

في بعض الحالات، يصعب توفير أربع غرف منفصلة. هناك خيار ممكن، وإن كان أقل استحسانًا، وهو تحضير الخليط الرئيسي في منطقة احتواء، مثل خزانة التدفق الصفائحي. في حالة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل، يجب تحضير الخليط الرئيسي للجولة الثانية من التفاعل في المنطقة "النظيفة" لتحضير الخليط الرئيسي، ولكن يجب إجراء التلقيح بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسي في غرفة التضخيم، وإن أمكن في منطقة احتواء مخصصة (مثل خزانة التدفق الصفائحي).

تحتاج كل غرفة/منطقة إلى مجموعة منفصلة من الماصات، وأطراف المرشحات، ورفوف الأنابيب، والدوامات، وأجهزة الطرد المركزي (إن وجدت)، والأقلام، وكواشف المختبر العامة، ومعاطف المختبر، وعلب القفازات، مع ملصقات واضحة، تُحفظ في أماكن العمل المخصصة لها. يجب غسل اليدين وتغيير القفازات ومعاطف المختبر عند التنقل بين المناطق المخصصة. يجب عدم نقل الكواشف والمعدات من منطقة متسخة إلى منطقة نظيفة. في الحالات القصوى، حيث يلزم نقل الكاشف أو المُعدة إلى الخلف، يجب أولاً تطهيرها بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 10%، ثم مسحها بالماء المعقم.

ملحوظة

يجب تحضير محلول هيبوكلوريت الصوديوم ١٠٪ طازجًا يوميًا. عند استخدامه للتطهير، يجب الالتزام بمدة تلامس لا تقل عن ١٠ دقائق.
وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام المنتجات المتوفرة تجارياً والتي تم التحقق من صحتها كمواد مطهرة للأسطح تعمل على تدمير الحمض النووي إذا كانت توصيات السلامة المحلية لا تسمح باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم أو إذا كان هيبوكلوريت الصوديوم غير مناسب لتطهير الأجزاء المعدنية من المعدات.

من الناحية المثالية، ينبغي على الموظفين الالتزام بمبدأ سير العمل أحادي الاتجاه، وعدم الانتقال من المناطق الملوثة (بعد فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل) إلى المناطق النظيفة (قبل الفحص) في نفس اليوم. ومع ذلك، قد تكون هناك حالات لا مفر منها. في هذه الحالة، يجب على الموظفين الحرص على غسل أيديهم جيدًا، وتغيير القفازات، وارتداء المعطف المخبري المخصص، وعدم إدخال أي معدات يرغبون في إخراجها من الغرفة مرة أخرى، مثل كتب المختبر. يجب التركيز على هذه التدابير الرقابية في تدريب الموظفين على الأساليب الجزيئية.

بعد الاستخدام، يجب تنظيف مساحات العمل بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 10% (ثم ماء معقم لإزالة بقايا المُبيِّض)، أو إيثانول بتركيز 70%، أو مُطهِّر مُعتمد تجاريًا مُدمِّر للحمض النووي. يُفضَّل تركيب مصابيح الأشعة فوق البنفسجية (UV) لتمكين التطهير بالإشعاع. مع ذلك، يجب حصر استخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في مناطق العمل المغلقة، مثل خزائن السلامة، للحد من تعرض موظفي المختبر للأشعة فوق البنفسجية. يُرجى الالتزام بتعليمات الشركة المُصنِّعة للعناية بمصابيح الأشعة فوق البنفسجية وتهويتها وتنظيفها لضمان استمرار فعاليتها.

في حالة استخدام 70% من الإيثانول بدلاً من هيبوكلوريت الصوديوم، فسوف تكون هناك حاجة إلى التعرض للأشعة فوق البنفسجية لاستكمال عملية التطهير.
لا تنظف الدوامة وجهاز الطرد المركزي باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم؛ بل امسحها بإيثانول ٧٠٪؜ وعرِّضها للأشعة فوق البنفسجية، أو استخدم مُطهِّرًا تجاريًا مُدمِّرًا للحمض النووي. في حالة الانسكابات، استشر الشركة المُصنِّعة لمزيد من نصائح التنظيف. إذا سمحت تعليمات الشركة المُصنِّعة بذلك، يجب تعقيم الماصات بانتظام باستخدام جهاز التعقيم بالبخار. إذا تعذر تعقيم الماصات بالبخار، فيكفي تنظيفها باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم ١٠٪؜ (ثم مسحها جيدًا بالماء المُعقَّم) أو باستخدام مُطهِّر تجاري مُدمِّر للحمض النووي ثم تعريضها للأشعة فوق البنفسجية.

قد يؤدي التنظيف باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم عالي النسبة إلى إتلاف بلاستيك الماصة ومعادنها في حال استخدامه بانتظام؛ لذا يُرجى مراجعة توصيات الشركة المصنعة أولًا. يجب معايرة جميع المعدات بانتظام وفقًا للجدول الزمني المُوصى به من الشركة المصنعة. يجب أن يكون هناك شخص مُعين مسؤولاً عن ضمان الالتزام بجدول المعايرة، والاحتفاظ بسجلات مُفصلة، ​​وعرض ملصقات الصيانة بوضوح على المعدات.

3. نصائح الاستخدام والتنظيف للمساحة الجزيئية المخصصة

ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل: تقسيم الكواشف/تحضير المزيج الرئيسي: يجب أن تكون هذه المنطقة أنظف الأماكن المستخدمة لتحضير التجارب الجزيئية، ويُفضل أن تكون خزانة تدفق صفائحي مُخصصة ومُجهزة بضوء فوق بنفسجي. يُمنع التعامل مع العينات والأحماض النووية المُستخلصة ومنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المُضخّمة في هذه المنطقة. يجب حفظ كواشف التضخيم في مُجمد (أو ثلاجة، وفقًا لتوصيات الشركة المُصنّعة) في نفس المكان المُخصص، ويُفضل بجوار خزانة التدفق الصفائحي أو منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب تغيير القفازات في كل مرة عند دخول منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو خزانة التدفق الصفائحي.

يجب تنظيف منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو خزانة التدفق الصفائحي قبل الاستخدام وبعده على النحو التالي: امسح جميع العناصر الموجودة في الخزانة، مثل الماصات، وصناديق الأطراف، والدوامة، وأجهزة الطرد المركزي، ورفوف الأنابيب، والأقلام، وما إلى ذلك، باستخدام إيثانول بنسبة 70% أو مُطهّر تجاري مُدمّر للحمض النووي، واتركه ليجف. في حالة منطقة العمل المغلقة، مثل خزانة التدفق الصفائحي، عُرّض الغطاء للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

ملحوظة

لا تُعرِّض الكواشف للأشعة فوق البنفسجية؛ انقلها إلى الخزانة فقط بعد تنظيفها. في حال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي، قد يكون من المفيد أيضًا مسح الأسطح والمعدات بمحلول يُفكك إنزيمات الريناز عند ملامستها. قد يُساعد ذلك على تجنب النتائج السلبية الكاذبة الناتجة عن تحلل الحمض النووي الريبي بواسطة الإنزيم. بعد إزالة التلوث وقبل تحضير الخليط الرئيسي، يجب تغيير القفازات مرة أخرى، ثم تكون الخزانة جاهزة للاستخدام.

ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل: استخلاص الأحماض النووية/إضافة القالب:

يجب استخلاص الحمض النووي ومعالجته في منطقة مخصصة ثانية، باستخدام مجموعة منفصلة من الماصات، وأطراف المرشحات، ورفوف الأنابيب، وقفازات جديدة، ومعاطف المختبر، وغيرها من المعدات. هذه المنطقة مخصصة أيضًا لإضافة القالب، وأدوات التحكم، وخطوط الاتجاه إلى أنابيب أو ألواح الخلطة الرئيسية. لتجنب تلوث عينات الحمض النووي المستخرجة التي يتم تحليلها، يُنصح بتغيير القفازات قبل التعامل مع أدوات التحكم أو المعايير الإيجابية، واستخدام مجموعة منفصلة من الماصات. يجب عدم استخدام كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والمنتجات المُضخّمة في هذه المنطقة. يجب تخزين العينات في ثلاجات أو مجمدات مخصصة في نفس المنطقة. يجب تنظيف مساحة عمل العينات بنفس طريقة تنظيف مساحة الخلطة الرئيسية.

ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل: التضخيم والتعامل مع المنتج المُضخّم

هذه المساحة المخصصة لعمليات ما بعد التضخيم، ويجب أن تكون منفصلة فعليًا عن مناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل. عادةً ما تحتوي على أجهزة تدوير حراري ومنصات آنية، ويُفضل أن تحتوي على خزانة تدفق رقائقي لإضافة ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من الجولة الأولى إلى تفاعل الجولة الثانية، في حال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل. يُمنع التعامل مع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل والأحماض النووية المستخلصة في هذه المنطقة نظرًا لارتفاع خطر التلوث. يجب أن تحتوي هذه المنطقة على مجموعة منفصلة من القفازات، ومعاطف المختبر، ورفوف الصفائح والأنابيب، والماصات، وأطراف المرشحات، والصناديق، وغيرها من المعدات. يجب طرد الأنابيب مركزيًا قبل فتحها. يجب تنظيف مساحة عمل العينات بنفس طريقة تنظيف مساحة الخلطة الرئيسية.

ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل: تحليل المنتج

هذه الغرفة مخصصة لمعدات كشف المنتجات، مثل خزانات الرحلان الكهربائي للهلام، ووحدات الطاقة، وجهاز الإضاءة فوق البنفسجية، ونظام توثيق الهلام. يجب أن تحتوي هذه المنطقة على مجموعات منفصلة من القفازات، ومعاطف المختبر، ورفوف الصفائح والأنابيب، والماصات، وأطراف المرشحات، والصناديق، وغيرها من المعدات. يُمنع إدخال أي كواشف أخرى إلى هذه المنطقة، باستثناء صبغة التحميل، والعلامة الجزيئية، وهلام الأغاروز، ومكونات العازل. يجب تنظيف مساحة عمل العينات بنفس طريقة تنظيف مساحة الخلطة الرئيسية.

ملاحظة هامة

يُفضّل عدم دخول غرف ما قبل فحص PCR في نفس اليوم إذا كان العمل قد أُنجز في غرف ما بعد الفحص. إذا كان ذلك لا مفر منه، فتأكد من غسل اليدين جيدًا أولًا وارتداء معاطف المختبر الخاصة في الغرف. يجب عدم إدخال كتب وأوراق المختبر إلى غرف ما قبل فحص PCR إذا استُخدمت في غرف ما بعد الفحص؛ وإذا لزم الأمر، يُرجى إحضار نسخ مطبوعة من البروتوكولات/بطاقات تعريف العينات، وما إلى ذلك.

4. نصائح عامة في علم الأحياء الجزيئي

استخدم قفازات خالية من البودرة لتجنب تثبيط التحليل. يُعدّ استخدام تقنية الماصة الصحيحة أمرًا بالغ الأهمية للحد من التلوث. قد يؤدي استخدام الماصة بشكل غير صحيح إلى تناثر السوائل عند توزيعها وتكوّن الهباء الجوي. يُمكنك الاطلاع على أفضل الممارسات لاستخدام الماصة بشكل صحيح من خلال الروابط التالية: دليل جيلسون لاستخدام الماصة، وفيديوهات تقنية استخدام الماصة من أناكيم، وأنابيب الطرد المركزي قبل فتحها، وافتحها بحرص لتجنب تناثر السوائل. أغلق الأنابيب فورًا بعد الاستخدام لتجنب دخول الملوثات.

عند إجراء تفاعلات متعددة، حضّر مزيجًا رئيسيًا واحدًا يحتوي على كواشف شائعة (مثل الماء، dNTPs، محلول منظم، بادئات، وإنزيم) لتقليل عدد عمليات نقل الكواشف وتقليل خطر التلوث. يُنصح بتحضير المزيج الرئيسي على ثلج أو كتلة باردة. قد يساعد استخدام إنزيم البدء الساخن على تقليل إنتاج منتجات غير محددة. احمِ الكواشف التي تحتوي على مجسات فلورية من الضوء لتجنب التحلل.

5. الضوابط الداخلية

يجب تضمين ضوابط إيجابية وسلبية مُحددة ومُؤكدة، بالإضافة إلى ضوابط بدون قالب في جميع التفاعلات، وخط اتجاه مُعاير متعدد النقاط للتفاعلات الكمية. يجب ألا تكون الضبطة الإيجابية قوية لدرجة تُشكل خطر تلوث. يجب تضمين ضوابط استخلاص إيجابية وسلبية عند إجراء استخلاص الأحماض النووية.

يُنصح بنشر تعليمات واضحة في كل منطقة ليُطلع المستخدمون على قواعد السلوك. قد ترغب مختبرات التشخيص التي تكتشف مستويات منخفضة جدًا من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) في العينات السريرية في اعتماد إجراء أمني إضافي يتمثل في تركيب أنظمة معالجة هواء منفصلة بضغط هواء موجب قليلًا في غرف ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وضغط هواء سالب قليلًا في غرف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.

وأخيرًا، يُعدّ وضع خطة لضمان الجودة أمرًا مفيدًا. ينبغي أن تتضمن هذه الخطة قوائم بمخزونات الكواشف الرئيسية ومخزونات العمل، وقواعد تخزين الأدوات والكواشف، وإعداد تقارير نتائج المراقبة، وبرامج تدريب الموظفين، وخوارزميات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والإجراءات التصحيحية عند الحاجة.

6. قائمة المراجع

أصلان أ، كينزلمان ج، دريلين هـ، أنانيفا ت، لافاندر ج. الفصل 3: إنشاء مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). وثيقة إرشادية لاختبار المياه الترفيهية باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لوكالة حماية البيئة الأمريكية، رقم 1611. جامعة ولاية ميشيغان - لانسينغ.

هيئة الصحة العامة في إنجلترا، هيئة الخدمات الصحية الوطنية. معايير المملكة المتحدة لبحوث علم الأحياء الدقيقة: ممارسات المختبر الجيدة عند إجراء اختبارات التضخيم الجزيئي. إرشادات الجودة. 2013؛4(4):1-15.

ميفلين ت. إنشاء مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل. بروتوكول كولد سبرينغ هارب. 2007؛7.

شرودر س. ٢٠١٣. الصيانة الدورية لأجهزة الطرد المركزي: تنظيف وصيانة وتطهير أجهزة الطرد المركزي والدوارات والمحولات (الورقة البيضاء رقم ١٤). هامبورغ: إيبندورف؛ ٢٠١٣.

فيانا ر.ف، واليس س.ل. الممارسات المختبرية السريرية الجيدة (GCLP) للاختبارات الجزيئية المستخدمة في المختبرات التشخيصية، في: أكيار إ، محرر. نطاق واسع لمراقبة الجودة. رييكا، كرواتيا: إنتك؛ 2011: 29-52.