Molekulêre opsporingsmetodes het die vermoë om 'n groot volume nukleïensuur te produseer deur die amplifikasie van spoorhoeveelhede wat in monsters voorkom. Alhoewel dit voordelig is om sensitiewe opsporing moontlik te maak, bring dit ook die moontlikheid van kontaminasie in deur die verspreiding van amplifikasie-aërosole in die laboratoriumomgewing. Wanneer eksperimente uitgevoer word, kan maatreëls getref word om die kontaminasie van reagense, laboratoriumtoerusting en werkbankruimte te vermy, aangesien sulke kontaminasie vals-positiewe (of vals-negatiewe) resultate kan genereer.
Om die waarskynlikheid van kontaminasie te verminder, moet Goeie Laboratoriumpraktyk te alle tye toegepas word. Spesifiek moet voorsorgmaatreëls getref word rakende die volgende punte:
1. Hantering van reagense
2. Organisasie van werkruimte en toerusting
3. Gebruiks- en skoonmaakadvies vir die aangewese molekulêre ruimte
4. Algemene molekulêre biologie-advies
5. Interne beheermaatreëls
6. Bibliografie
1. Hantering van reagense
Sentrifugeer reagensbuise kortliks voor oopmaak om die vorming van aërosols te vermy. Verdeel reagense in alikwote om veelvuldige vries-ontdooiings en die kontaminasie van die hoofvoorraad te vermy. Merk en dateer alle reagens- en reaksiebuise duidelik en hou logboeke van reagenslot- en bondelnommers wat in alle eksperimente gebruik is. Pipetteer alle reagense en monsters met behulp van filterpunte. Voor aankoop is dit raadsaam om met die vervaardiger te bevestig dat die filterpunte pas by die handelsmerk van die pipet wat gebruik gaan word.
2. Organisasie van werkruimte en toerusting
Die werkruimte moet so georganiseer word dat die werkvloei in een rigting plaasvind, van skoon areas (voor-PCR) tot vuil areas (na-PCR). Die volgende algemene voorsorgmaatreëls sal help om die kans op kontaminasie te verminder. Hê aparte aangewese kamers, of ten minste fisies aparte areas, vir: meestermengselvoorbereiding, nukleïensuurekstraksie en DNS-sjabloonbyvoeging, amplifikasie en hantering van geamplifiseerde produk, en produkanalise, bv. gelelektroforese.
In sommige omgewings is dit moeilik om 4 aparte kamers te hê. 'n Moontlike, maar minder wenslike opsie is om die meestermengselvoorbereiding in 'n inperkingsarea te doen, bv. 'n laminêre vloeikabinet. In die geval van geneste PCR-amplifikasie, moet die voorbereiding van die meestermengsel vir die tweede ronde reaksie in die 'skoon' area vir meestermengselvoorbereiding voorberei word, maar die inokulasie met die primêre PCR-produk moet in die amplifikasiekamer gedoen word, en indien moontlik in 'n toegewyde inperkingsarea (bv. 'n laminêre vloeikabinet).
Elke kamer/area benodig 'n aparte stel duidelik gemerkte pipette, filterpunte, buisrakke, vortexe, sentrifuges (indien relevant), penne, generiese laboratoriumreagense, laboratoriumjasse en bokse handskoene wat by hul onderskeie werkstasies sal bly. Hande moet gewas word en handskoene en laboratoriumjasse moet omgeruil word wanneer tussen die aangewese areas beweeg word. Reagense en toerusting moet nie van 'n vuil area na 'n skoon area verskuif word nie. Indien 'n uiterste geval ontstaan waar 'n reagens of stuk toerusting agteruit geskuif moet word, moet dit eers met 10% natriumhipochloriet gedekontamineer word, gevolg deur 'n afvee met steriele water.
Nota
Die 10% natriumhipochlorietoplossing moet daagliks vars aangemaak word. Wanneer dit vir dekontaminasie gebruik word, moet 'n minimum kontaktyd van 10 minute nagekom word.
Alternatiewelik kan kommersieel beskikbare produkte wat as DNS-vernietigende oppervlakontsmettingsmiddels gevalideer is, gebruik word indien plaaslike veiligheidsaanbevelings nie die gebruik van natriumhipochloriet toelaat nie, of indien natriumhipochloriet nie geskik is vir die ontsmetting van die metaalonderdele van toerusting nie.
Ideaal gesproke moet personeel die eenrigtingwerkvloei-etos nakom en nie op dieselfde dag van vuil areas (na-PCR) teruggaan na skoon areas (voor-PCR) nie. Daar kan egter geleenthede wees wanneer dit onvermydelik is. Wanneer so 'n geleentheid ontstaan, moet personeel sorg dra dat hulle hul hande deeglik was, handskoene omruil, die aangewese laboratoriumjas gebruik en geen toerusting wat hulle weer uit die kamer wil neem, soos laboratoriumboeke, inbring nie. Sulke beheermaatreëls moet beklemtoon word in personeelopleiding oor molekulêre metodes.
Na gebruik moet werkplekke skoongemaak word met 10% natriumhipochloriet (gevolg deur steriele water om oorblywende bleikmiddel te verwyder), 70% etanol, of 'n gevalideerde kommersieel beskikbare DNS-vernietigende dekontaminant. Ideaal gesproke moet ultraviolet (UV) lampe aangebring word om dekontaminasie deur bestraling moontlik te maak. Die gebruik van UV-lampe moet egter beperk word tot geslote werkareas, bv. veiligheidskaste, om die laboratoriumpersoneel se UV-blootstelling te beperk. Volg asseblief die vervaardiger se instruksies vir UV-lampversorging, ventilasie en skoonmaak om te verseker dat lampe effektief bly.
Indien 70% etanol in plaas van natriumhipochloriet gebruik word, sal bestraling met UV-lig nodig wees om die dekontaminasie te voltooi.
Moenie die vortex en sentrifuge met natriumhipochloriet skoonmaak nie; vee eerder af met 70% etanol en stel dit bloot aan UV-lig, of gebruik 'n kommersiële DNS-vernietigende dekontaminant. Vir gemorste vloeistof, raadpleeg die vervaardiger vir verdere skoonmaakadvies. Indien die vervaardiger se instruksies dit toelaat, moet pipette roetinegewys deur 'n outoklaaf gesteriliseer word. Indien pipette nie outoklaaf kan word nie, behoort dit voldoende te wees om hulle skoon te maak met 10% natriumhipochloriet (gevolg deur 'n deeglike afvee met steriele water) of met 'n kommersiële DNS-vernietigende dekontaminant gevolg deur UV-blootstelling.
Skoonmaak met hoë-persentasie natriumhipochloriet kan uiteindelik pipetplastiek en -metale beskadig indien dit gereeld gedoen word; kyk eers na die aanbevelings van die vervaardiger. Alle toerusting moet gereeld gekalibreer word volgens die vervaardiger se aanbevole skedule. 'n Aangewese persoon moet toesig hou dat die kalibrasieskedule nagekom word, gedetailleerde logboeke gehou word en diensetikette duidelik op toerusting vertoon word.
3. Gebruiks- en skoonmaakadvies vir die aangewese molekulêre ruimte
Voor-PCR: Reagensalikwotasie / meestermengselvoorbereiding: Dit moet die skoonste van alle ruimtes wees wat gebruik word vir die voorbereiding van molekulêre eksperimente en behoort ideaal gesproke 'n aangewese laminêre vloeikabinet te wees wat met 'n UV-lig toegerus is. Monsters, geëkstraheerde nukleïensuur en versterkte PCR-produkte moet nie in hierdie area hanteer word nie. Amplifikasiereagense moet in 'n vrieskas (of yskas, volgens die vervaardiger se aanbevelings) in dieselfde aangewese ruimte gehou word, ideaal gesproke langs die laminêre vloeikabinet of voor-PCR-area. Handskoene moet elke keer vervang word wanneer die voor-PCR-area of laminêre vloeikabinet betree word.
Die voor-PCR-area of laminêre vloei-kabinet moet voor en na gebruik soos volg skoongemaak word: Vee alle items in die kabinet af, bv. pipette, puntbokse, vortex, sentrifuge, buisrakke, penne, ens. met 70% etanol of 'n kommersiële DNS-vernietigende dekontaminant, en laat dit droog word. In die geval van 'n geslote werkarea, bv. 'n laminêre vloei-kabinet, stel die kap vir 30 minute aan UV-lig bloot.
Nota
Moenie reagense aan UV-lig blootstel nie; skuif dit eers in die kabinet sodra dit skoon is. Indien omgekeerde transkripsie-PCR uitgevoer word, kan dit ook nuttig wees om oppervlaktes en toerusting af te vee met 'n oplossing wat RNase met kontak afbreek. Dit kan help om vals-negatiewe resultate as gevolg van ensiem-afbraak van RNA te vermy. Na dekontaminasie en voor die voorbereiding van die meestermengsel, moet handskoene weer omgeruil word, en dan is die kabinet gereed vir gebruik.
Voor-PCR: Nukleïensuur-ekstraksie/template-toevoeging:
Nukleïensuur moet in 'n tweede aangewese area geëkstraheer en hanteer word, met behulp van 'n aparte stel pipette, filterpunte, buisrakke, vars handskoene, laboratoriumjasse en ander toerusting. Hierdie area is ook vir die byvoeging van sjabloon, kontroles en tendenslyne tot die meestermengbuise of -plate. Om kontaminasie van die geëkstraheerde nukleïensuurmonsters wat geanaliseer word, te vermy, word dit aanbeveel om handskoene te vervang voordat positiewe kontroles of standaarde hanteer word en om 'n aparte stel pipette te gebruik. PCR-reagense en versterkte produkte moet nie in hierdie area gepipetteer word nie. Monsters moet in aangewese yskaste of vrieskaste in dieselfde area gestoor word. Die monsterwerkruimte moet op dieselfde manier as die meestermengruimte skoongemaak word.
Post-PCR: Amplifikasie en hantering van die geamplifiseerde produk
Hierdie aangewese ruimte is vir na-amplifikasieprosesse en moet fisies apart wees van die voor-PCR-areas. Dit bevat gewoonlik termosikleerders en intydse platforms, en ideaal gesproke moet dit 'n laminêre vloei-kabinet hê vir die byvoeging van die ronde 1 PCR-produk by die ronde 2-reaksie, indien geneste PCR uitgevoer word. PCR-reagense en geëkstraheerde nukleïensuur moet nie in hierdie area hanteer word nie, aangesien die risiko van kontaminasie hoog is. Hierdie area moet 'n aparte stel handskoene, laboratoriumjasse, plaat- en buisrakke, pipette, filterpunte, houers en ander toerusting hê. Buise moet gesentrifugeer word voor oopmaak. Die monsterwerkruimte moet op dieselfde manier as die meestermengruimte skoongemaak word.
Post-PCR: Produkontleding
Hierdie kamer is vir produkopsporingstoerusting, bv. gel-elektroforese-tenks, kragpakke, UV-transilluminator en die gel-dokumentasiestelsel. Hierdie area moet aparte stelle handskoene, laboratoriumjasse, plaat- en buisrakke, pipette, filterpunte, houers en ander toerusting hê. Geen ander reagense kan in hierdie area ingebring word nie, behalwe laaikleurstof, molekulêre merker en agarosegel, en bufferkomponente. Die monsterwerkruimte moet op dieselfde manier as die meestermengruimte skoongemaak word.
Belangrike nota
Ideaal gesproke moet die voor-PCR-kamers nie op dieselfde dag betree word as werk reeds in die na-PCR-kamers verrig is nie. Indien dit heeltemal onvermydelik is, maak seker dat hande eers deeglik gewas word en dat spesifieke laboratoriumjasse in die kamers gedra word. Laboratoriumboeke en papierwerk moet nie in die voor-PCR-kamers geneem word as dit in die na-PCR-kamers gebruik is nie; indien nodig, neem duplikaatafdrukke van protokolle/monster-ID's, ens.
4. Algemene molekulêre biologie-advies
Gebruik poeiervrye handskoene om toetsinhibisie te vermy. Die korrekte pipettegniek is van kardinale belang om kontaminasie te verminder. Verkeerde pipetering kan lei tot spatsels wanneer vloeistowwe toegedien word en die vorming van aërosols. Goeie praktyk vir korrekte pipetering kan gevind word by die volgende skakels: Gilson-gids vir pipetering, Anachem-pipettegniekvideo's, Sentrifugeer buise voor oopmaak, en maak dit versigtig oop om spatsels te vermy. Maak buise onmiddellik na gebruik toe om die toediening van kontaminante te vermy.
Wanneer veelvuldige reaksies uitgevoer word, berei een meestermengsel voor wat algemene reagense bevat (bv. water, dNTP's, buffer, primers en ensiem) om die aantal reagensoordragte te verminder en die bedreiging van kontaminasie te verminder. Dit word aanbeveel om die meestermengsel op ys of 'n koue blok op te stel. Die gebruik van 'n Warm Begin-ensiem kan help om die produksie van nie-spesifieke produkte te verminder. Beskerm reagense wat fluorescerende probes bevat teen lig om degradasie te voorkom.
5. Interne beheermaatreëls
Sluit goed gekarakteriseerde, bevestigde positiewe en negatiewe kontroles in, tesame met 'n geen-sjabloonkontrole in alle reaksies, en 'n meerpunt-getitreerde tendenslyn vir kwantitatiewe reaksies. Die positiewe kontrole moet nie so sterk wees dat dit 'n kontaminasierisiko inhou nie. Sluit positiewe en negatiewe ekstraksiekontroles in wanneer nukleïensuurekstraksie uitgevoer word.
Dit word aanbeveel dat duidelike instruksies in elk van die areas geplaas word sodat gebruikers bewus is van gedragsreëls. Diagnostiese laboratoriums wat baie lae vlakke van DNS of RNS in kliniese monsters opspoor, wil dalk die bykomende sekuriteitsmaatreël instel om aparte lughanteringstelsels te hê met effens positiewe lugdruk in die voor-PCR-kamers en effens negatiewe lugdruk in die na-PCR-kamers.
Laastens is die ontwikkeling van 'n gehalteversekeringsplan (QA) nuttig. So 'n plan moet lyste van reagensmeestervoorrade en werkvoorrade, reëls vir die berging van stelle en reagense, rapportering van beheerresultate, personeelopleidingsprogramme, probleemoplossingsalgoritmes en remediërende stappe wanneer nodig insluit.
6. Bibliografie
Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Hoofstuk 3: Opstel van 'n qPCR-laboratorium. 'n Riglyndokument vir die toets van ontspanningswater met behulp van USEPA qPCR-metode 1611. Lansing-Michigan State University.
Openbare Gesondheid Engeland, NHS. VK-standaarde vir mikrobiologiese ondersoeke: Goeie Laboratoriumpraktyk wanneer molekulêre amplifikasietoetse uitgevoer word). Kwaliteitsriglyne. 2013;4(4):1–15.
Mifflin T. Oprigting van 'n PCR-laboratorium. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Schroeder S 2013. Roetine-instandhouding van sentrifuges: skoonmaak, instandhouding en ontsmetting van sentrifuges, rotors en adapters (Witboek nr. 14). Hamburg: Eppendorf; 2013.
Viana RV, Wallis CL. Goeie Kliniese Laboratoriumpraktyk (GCLP) vir molekulêr-gebaseerde toetse wat in diagnostiese laboratoriums gebruik word, In: Akyar I, redakteur. Wye spektra van kwaliteitsbeheer. Rijeka, Kroasië: Intech; 2011: 29–52.
Plasingstyd: 16 Julie 2020
